微生物多樣性分析方法精選(九篇)

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第1篇：微生物多樣性分析方法范文

關(guān)鍵詞：土壤；細菌；多樣性；DGGE

土壤中微生物種類極其豐富，文獻曾報道，1g農(nóng)田土壤中就含有幾百萬細菌、數(shù)十萬真菌孢子和數(shù)萬個原生動物和藻類[1]。微生物以它所具有的各種生物化學活性 ，積極參與土壤中各種物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程 ，是土壤中各種生物化學和生理學過程動態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)者。目前在生態(tài)學和環(huán)境科學的研究領(lǐng)域，關(guān)于土壤微生物尤其是土壤中微生物多樣性及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用的研究越來越受到重視；而傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)分離方法研究土壤微生物多樣性有很大的缺陷，能夠人工培養(yǎng)的土壤微生物的數(shù)量只占其總數(shù)的1%左右[2]，且這種分離培養(yǎng)方法不能很好地反映土壤微生物多樣性的原始狀態(tài)等[3]，這就使得采用新的技術(shù)和方法顯得尤為必要。

變性梯度凝膠電泳技術(shù)（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）作為一種DNA指紋圖譜技術(shù)，最先由Muzyer等于1993年將其應用于微生物生態(tài)學研究[4]，證實了該技術(shù)在研究自然界微生物群落的種群差異和遺傳多樣性方面具有明顯的優(yōu)越性。DGGE因其可靠、方便快捷、重現(xiàn)性好等特點，迅速成為微生物群落多樣性和動態(tài)分析的強有力工具[5]。目前廣泛運用于土壤、水體、食品、活性污泥等各種樣品中的微生物多樣性檢測和種群演替的分析[6～9]。但昂貴的進口設(shè)備和比較復雜的操作，使得該技術(shù)在基層技術(shù)部門以及高等院校人才培養(yǎng)中的應用受到了限制。因此，選用適宜的引物，并對PCR及DGGE的實驗條件進行優(yōu)，以獲得較好的分析結(jié)果顯得尤為重要。本試驗優(yōu)化了DGGE電泳時間長度，篩選了最佳PCR引物，比較了兩種染色方法，得到了在國產(chǎn)DGGE系統(tǒng)分析土壤微生物多樣性的最佳條件。

1、材料與方法

1.1、試驗材料

試驗土壤樣品21個，于2011年9月采自許昌市襄城縣庾河村煙田?？緹熎贩N為當?shù)刂髟云贩N中煙100，種植方式為煙薯套種。對采集的土樣自然風干，研磨過100#篩子，裝袋標記，置于-20℃冰箱內(nèi)以備用。

1.2、試驗方法

1.2.1、土壤總DNA的提取

對處理過的土樣采用本實驗室優(yōu)化方法提取土樣總DNA。

1.2.2、PCR引物的設(shè)計和擴增體系的探索

（1） 引物合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公開的細菌基因組16S保守序列設(shè)計了4對細菌通用引物：引物對Eubac10F/Eubac1507R用于第一輪擴增，引物對BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3用于第二輪擴增，對樣品總DNA進行巢氏PCR擴增。為了便于對污染源進行追蹤，在PCR擴增過程中，都設(shè)立了陰性對照。對照除了不加模板DNA外，其它組分全部相同。引物序列均由北京博尚生物技術(shù)有限公司進行合成，詳見表1：

（3）巢式PCR擴增條件：

引物對Eubac10F/Eubac1507R的第一輪PCR擴增程序為：95℃ 5min，1個循環(huán)；94℃ 50s，52℃ 50s，72℃ 1min，28個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳。

引物對BV34F/BV56GC的第二輪PCR擴增程序為：95℃ 5min，1個循環(huán)；94℃ 40s，52℃ 45s，72℃ 45s，28個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測后用于DGGE電泳檢測。

引物對BV67F/BV89GC的第二輪PCR擴增程序為：95℃ 5min，1個循環(huán)；94℃ 40s，54℃ 45s，72℃ 45s，28個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測后用于DGGE電泳檢測。

引物對BacGC-P2/BacGC-P3的第二輪PCR擴增程序為：95℃ 5min，1個循環(huán)；94℃ 40s，57℃ 45s，72℃ 45s，28個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測后用于DGGE電泳檢測。

1.2.3、DGGE電泳時間長度的優(yōu)化

采用北京君意公司的梯度膠制備裝置（型號JY-TD331）進行垂直電泳。使用梯度混合器，配制聚丙烯酰胺凝膠的變性劑濃度梯度40%～ 60% （100%的變性劑為7mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺的混合物），凝膠濃度為6%，以引物對Eubac10F/Eubac1507R和引物對BV34F/BV56G的巢氏PCR產(chǎn)物為上樣模板，上樣50ul。設(shè)置電泳溫度60℃，電壓100V。電泳過程中，每2h上一次樣。電泳結(jié)束后，用EB染色15min。染色后凝膠用BIO IMAGING（美國UVP GelDoc-It Imaging Systems）的凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4、DGGE最佳引物對的篩選

配制聚丙烯酰胺凝膠的變性劑濃度梯度40%～60%，凝膠濃度為6%，以引物對BV34F/BV56GC、引物對BV67F/BV89GC和引物對BacGC-P2/BacGC-P3的相同樣品的第二輪PCR產(chǎn)物為上樣模板，根據(jù)上述已優(yōu)化的電泳時間和條件進行電泳。電泳結(jié)束后染色照相。

1.2.5、EB和硝酸銀兩種DGGE染色方法的比較

根據(jù)上述已優(yōu)化的電泳時間和最佳引物平行的跑兩塊變性梯度凝膠。電泳結(jié)束后，分別用EB和硝酸銀兩種方法染色。通過比較兩種染色方法的DGGE條帶的亮度和數(shù)目得出最佳染色方法。

2、結(jié)果與分析

2.1、巢氏PCR擴增結(jié)果

擴增結(jié)果表明，細菌16S區(qū)的第一輪PCR擴增條帶亮度高，其大小約為1500bp，符合預期，且無非特異性擴增，陰性對照無條帶。分別以BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3的第二輪擴增得到的條帶片段的大小都符合預期，且無非特異性擴增，陰性對照無條帶，說明巢式PCR擴增效果好，能夠滿足DGGE上樣要求。

2.2、DGGE電泳時間長度的優(yōu)化

選取的3個樣品的巢氏PCR產(chǎn)物（以10F/1507R和BV34F/BV56GC的巢氏PCR產(chǎn)物為例）每隔2h加一次樣，以確定最佳電泳時間。從圖1可看出，電泳時間8～10h時，DGGE條帶沒有完全分離；而電泳時間14h時，條帶整體過于偏下方，因此確定12h為最佳電泳時間。

2.3、最佳引物對篩選

選取5個樣品，分別以引物對BV34F/BV56GC、引物對BV67F/BV89GC和引物對BacGC-P2/BacGC-P3的第二輪PCR擴增產(chǎn)物為樣品，根據(jù)上述已優(yōu)化的條件平行跑三塊變性梯度凝膠，三塊膠除引物不同，其他條件完全相同。染色照相以觀察樣品條帶。從圖2可知，以引物對BV34F/BV56GC的第二輪PCR擴增產(chǎn)物的DGGE條帶數(shù)量多且亮，而以引物對BV67F/BV89GC和引物對BacGC-P2/BacGC-P3的第二輪PCR擴增產(chǎn)物條帶數(shù)較少并且亮度不高。因此，選用10F/1507R和BV34F/BV56GC為組合進行巢氏PCR擴增和微生物多樣性測定。

2.4、EB和硝酸銀兩種DGGE染色方法的比較

選取5個樣品，以引物對10F/1507R和BV34F/56GC的巢氏PCR產(chǎn)物為上樣模板，根據(jù)上述以優(yōu)化的DGGE條件平行的跑兩塊變性梯度凝膠。電泳結(jié)束后，兩塊膠分別用EB和硝酸銀染色。試驗結(jié)果如圖3所示， EB染色圖譜清晰，且操作簡單，染色條件要求不是太苛刻；硝酸銀染色方法雖然靈敏性較高，但是操作復雜，每一步都要求非常精確。因此，選用EB對變性梯度凝膠染色。

3、討論

PCR—DGGE技術(shù)能夠直觀的體現(xiàn)出一個環(huán)境樣本的細菌群落組成和多樣性，推測出優(yōu)勢 種群，并可實現(xiàn)對多個樣品的快速同時分析，這是傳統(tǒng)的研究方法所無法比擬的。盡管DGGE技術(shù)存在一定的缺陷，但因其重現(xiàn)性強、可靠性高，可同時分析多個樣品，提供了群落中優(yōu)勢種群信息，彌補了傳統(tǒng)方法在分析微生物群落結(jié)構(gòu)方面的不足，已成為現(xiàn)代環(huán)境微生物生態(tài)學領(lǐng)域一種重要研究手段。

注：文中1～10表示不同的土樣

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基金項目：河南省煙草公司科技攻關(guān)項目（項目編號HYKJ200814）。

第2篇：微生物多樣性分析方法范文

Abstract： Polymerase chain reaction and denaturing gel gradient electrophoresis method （hereafter abbreviated as PCR-DGGE） is getting a larger range of application. China has a slow start in this field but it is still gradually taken seriously and researched and applied by people. This paper analyzes the application and prospect of this in the field of environmental engineering.

關(guān)鍵詞： 環(huán)境工程；DGGE技術(shù)；污水處理

Key words： environmental engineering；DGGE technique；sewage treatment

中圖分類號：X32 文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2014）03-0100-02

0 引言

基因工程是現(xiàn)代生物技術(shù)最為核心的內(nèi)容，屬于DNA的重新組合技術(shù)，也被稱為遺傳工程。該技術(shù)自問世以來已經(jīng)在諸多領(lǐng)域被廣泛研究和應用，這其中就涉及到環(huán)境工程。技術(shù)核心原理是一系列的DNA重組、拼接，實現(xiàn)該技術(shù)是在研究對象的細胞之外進行的。其目的是通過人為干涉來改變基因的組成。合理的使用該技術(shù)，能產(chǎn)生原有物質(zhì)本身不具備的特性；產(chǎn)生新的物種；合成能力更加強大?；蚬こ碳夹g(shù)已經(jīng)在環(huán)境項目中得到較好的應用，取得了相應的成果。

1 DGGE實現(xiàn)的基本原理

DNA指紋技術(shù)就是變性梯度凝膠電泳技術(shù)。屬于眾多的多態(tài)性分析技術(shù)中的一種。研究對象的DNA使用具有化學變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，所使用的凝膠能有針對性的解鏈PCR的擴增產(chǎn)物。由于DNA雖然長度相同，在堿基序列上卻存在很大的差異。在DNA進行電泳時，雙鏈的解鏈所需要的變性劑濃度不同。在相應的變性劑濃度下序列不同的DN段發(fā)生變性，產(chǎn)生其空間構(gòu)型上的變化。雙鏈DNA在開始的時候會以線狀移向正極，當變性劑濃度逐漸增加后，G+C含量低含量的序列的部分會逐漸被打開，G+C高含量的部分仍然是雙鏈狀態(tài)。一旦DNA的雙鏈解鏈后，其分子端部的叉狀、中間的環(huán)形會發(fā)生部分熔化。此時，點用速度在聚丙烯酰胺凝膠中將會急速降低甚至停留在相對應的變性計對應的位置。經(jīng)過染色之后以分開的條帶形式呈現(xiàn)于凝膠之上。以上步驟可實現(xiàn)同長但有序列差異的DAN分子有效分開，形成變性的梯度主要用尿素和甲酰胺。

2 DGGE技術(shù)在環(huán)境工程領(lǐng)域中的應用

PCR-DGGE技術(shù)能有效的避開傳統(tǒng)微生物技術(shù)的局限性。當DGGE技術(shù)進入環(huán)境工程的微生物生態(tài)領(lǐng)域之后，這種新生技術(shù)很快變?yōu)檠芯课⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)最主要的技術(shù)手段之一。在活性污泥與生物膜等生物處理系統(tǒng)中，微生物具有多樣性。在進行相關(guān)的檢測、微生物鑒定以及種群演替研究的時候，DGGE技術(shù)已被廣泛應用。

2.1 污水生物處理中的應用方法 污水微生物群在CR-DGGE技術(shù)改變下與既有技術(shù)有很大差異，在這個過程中研究人員有了新的認識。

污水中的好氧細菌群落結(jié)構(gòu)和功能在溫度升高時會發(fā)生很大變化。運用DGGE技術(shù)我們可以分析出，不同溫度環(huán)境會存在不同的細菌群落。

在同等的工作環(huán)境下，使用PCR-DGGE技術(shù)，跟蹤分使用低溫菌、常溫菌分別接種的兩套活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)，進行及時動態(tài)觀察。在相同工藝條件下，對低溫菌群與常溫菌群進行相同的操作，結(jié)果是：產(chǎn)生的微生物群結(jié)構(gòu)有很強的相似性。隨著時間的推移，這兩類菌群在結(jié)構(gòu)上的相似度越來越強。

去除污水中的氨和氮主要使用硝化方法。在這種硝化作用過程中氨氧化細菌負責將氨氧成亞硝酸鹽。這種實現(xiàn)亞硝化作用過程是硝化過程中重要的步驟。所使用的氨氧化細菌具有生長速度低、相對生物種群較少的特點。傳統(tǒng)的細菌分離、培養(yǎng)、分析方法，會消耗工作人員大量的時間。采用PCR擴增16SrDNA、功能基因并且隨機克隆測序等相關(guān)技術(shù)手段。在高濃度氨氮廢水處理系統(tǒng)的不同時間，分析并且處理活性污泥樣品、氨氧化細菌的種類和氨單加氧酶的活性。御用PCR-DGGE相結(jié)合的技術(shù)，針對樣品將總細菌群進行差異性研究。實驗證明，PCR-DGGE技術(shù)可以使我們更為深入、全面的了解氨氧化細菌的類群及其相關(guān)功能。

應用PCR-DGGE工藝對城市污水處理與完全混合的傳統(tǒng)式處理工藝進行了相關(guān)的實驗對比。在同一反應器的不同位置，微生物群的分布、不同工況下的微生物種群結(jié)構(gòu)進行了相關(guān)的分析、研究。研究表明，這兩種污水處理工藝中的微生物種群都具有很強的多樣性，區(qū)別是：兩者種群的結(jié)構(gòu)差異巨大。

采用生物滴濾反應器與生物濾池處理相同的污水，然后采用PCR-DGGE研究不同反應器或反應器的不同位置中氨氧化細菌菌群的組成。種群對反應器的形式或者位置的差異沒有任何依賴性，不會隨這些因素變化而變化。

2.2 PCR-DGGE技術(shù)在廢氣生物處理中的應用 生物濾池與生物濾塔是處理臭味、異味行之有效的好辦法，這種生物過濾技術(shù)可以對惡臭與揮發(fā)性油劑廢氣體很好的遏制，從而該技術(shù)能夠很快的推廣。

在除臭生物濾池中較強酸性與中性兩種不同運行環(huán)境下，運用PCR-DGGE技術(shù)研究，可以發(fā)現(xiàn)：微生物種群的多樣性與生物種群結(jié)構(gòu)上發(fā)生的改變。利用擴增細菌16SrRNA基因的V3可變區(qū)，運用相關(guān)技術(shù)分析濾池內(nèi)的種群變化?；厥沼醒芯恳饬x的DN段，與PCR測序、T載體克隆測序有效的結(jié)合。最終確定眾多種群中的優(yōu)勢菌群。微生物對強酸性環(huán)境有很大影響；中性條件下的微生物種群更為豐富。此外，濾池的層次上的差異，也導致了種群空間分布的差異性。實驗證明，除臭過程中硫氧化細菌占有相對明顯的優(yōu)勢。

影響生物濾塔處理效率以及反應器的穩(wěn)定運行的主要因素是塔中的微生物種群的結(jié)構(gòu)，以及微生物的多樣性。我們可以采用DGGE技術(shù)，對處理含氨廢氣的生物濾塔中的微生物進行多樣性研究。隨時間的推移，對反應器不同填料、不同時期微生物多樣性比對研究。證明：微生物的多樣性與反應器運行時間的長短有直接關(guān)系，隨著時間的不斷延長其多樣性會有所降低；將填料方法進行對比可知：如果是堆肥填料，其微生物多樣性更為豐富，反應器也能達到很好的效果。

2.3 PCR-DGGE技術(shù)在污泥生物處理中的應用 污泥的穩(wěn)定化在污泥處理過程中是一個相當重要的過程。在此過程當中，微生物的穩(wěn)定對于整個污泥系統(tǒng)的穩(wěn)定起到了至關(guān)重要的作用。專家們采用DGGE指紋圖譜技術(shù)，研究污泥堆肥工藝中的細菌種群動態(tài)變化和種群的多樣性。研究證明：生物法污泥堆肥時間不大于8d。采用DGGE指紋圖譜與相似性系數(shù)Cs值對污泥堆肥各工藝環(huán)節(jié)樣品進行相關(guān)分析，可以發(fā)現(xiàn)，反應時間的持續(xù)，導致了微生態(tài)結(jié)構(gòu)的Cs值逐漸增高。這說明：微生物種群結(jié)構(gòu)會逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)。污泥微生態(tài)種群可以迅速進行選擇，進而調(diào)整內(nèi)部細菌種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)。

采用PCR-DGGE技術(shù)，可以科學、直觀的研究出環(huán)境中細菌群落及多樣性。我們需要避開DGGE技術(shù)的先天缺陷，這就需要我們的科研工作人員，在該領(lǐng)域繼續(xù)加大研究力度，為環(huán)境工程做出更大貢獻。

參考文獻：

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第3篇：微生物多樣性分析方法范文

關(guān)鍵詞：環(huán)境工程；分子生物；微生物；應用

前言：作為集環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境工程、保護學以及微生物學于一體的學科，微生物學在不斷發(fā)展中逐漸衍生出較多亟待解決的問題。盡管近年來有較多先進理念與技術(shù)被引入該學科中，但對于部分環(huán)境監(jiān)測或環(huán)境凈化等問題，所取得的效果并不理想，要求充分發(fā)揮分子生物技術(shù)的優(yōu)勢。因此，本文對環(huán)境工程微生物中分子微生物技術(shù)的應用分析，具有十分重要的意義。

1分子生物技術(shù)的相關(guān)概述

1.1測序技術(shù)

細胞中的rDNA本身表現(xiàn)出明顯的高突序列、保守序列以及穩(wěn)定特征，但其是分類微生物中的指標之一。通常測序分析中，為使微生物種群得以分析，對分離物或分類單元進行確定，便需借助rRNA分析方式。從該基因序列的類型看，有較多如16SrRNA、23SrRNA與5sRNA，其中后兩者包含的含核苷酸分別過多與過少，很難為測序分析提供指導。所以在原核生物系統(tǒng)研究中，可考慮將16SrRNA引入。具體測定中，會在如TA克隆試劑、PGEM-T克隆試劑等載體應用下，克隆PCR產(chǎn)物，完成文庫構(gòu)建過程，在此基礎(chǔ)上結(jié)合16SrRNA基因測序結(jié)果，可通過其與文庫中的序列做好對比，判斷是否有相對應或相似微生物種類。另外，也可對rDNA多樣性利用電泳分離進行顯示，或直接通過RFLP對擴增產(chǎn)物做好分析。通過這些測序方法的應用，對微生物系統(tǒng)發(fā)育的研究可起到重要作用[1]。

1.2核酸技術(shù)

核酸技術(shù)在分子生物技術(shù)中極為常見，可具體細化為PCR-SSCP、PCR-DGGE與PCR-RFLP等技術(shù)。以其中PCR-SSCP技術(shù)為例，其以往運用中多局限在基因突變方面，是臨床醫(yī)學中的常用方法，經(jīng)過不斷發(fā)展被引入到微生物生態(tài)學中。從其實現(xiàn)原理看，主要以單鏈DNA空間折疊構(gòu)象為基礎(chǔ)，若其中有堿基出現(xiàn)變化，空間構(gòu)象會隨之發(fā)生變化，配合聚丙烯酰胺凝膠電泳的應用，使DNA譜帶得以生成。以16SrRNA測序在廢水生物中的表現(xiàn)為例，便可借助PCR-SSCP，對細菌群落受培養(yǎng)基變化的影響進行分析。再如PCR-DGGE，應用中一般強調(diào)將基因組DNA從環(huán)境樣品內(nèi)被提取，在此基礎(chǔ)上將PCR擴增技術(shù)引入，可達到擴增DNA的目標，此時可將聚丙烯酰胺凝膠與擴增產(chǎn)物相結(jié)合，通過電泳作用分離雙鏈DN段，最終生成的將為單鏈DNA譜帶。最后便可對譜帶中展現(xiàn)的堿基序列與文庫內(nèi)序列做好對比分析，完成微生物種屬的界定。由于該技術(shù)具有較好的分離效果，操作較為簡便，所以在微生物分析中的應用較為常見，如對微生物種群在活性污泥中的情況判斷，將該技術(shù)引入，可起到良好的效果。另外，在PCR-RFLP技術(shù)方面，其主要借助核酸特異位點、DNA識別序列，對雙鏈DNA進行切割，配合溴化乙錠凝膠的應用，無需通過放射性標記形式，便可達到DN段分析目標。如土壤中微生物的判斷，便可借助該技術(shù)實現(xiàn)。

1.3基因探針

目前分子生物技術(shù)中，基因探針的引入主要借助熒光染料、放射性同位素，對樣品內(nèi)核酸進行識別分析。對于該技術(shù)，也表現(xiàn)在核酸印跡、熒光原位以及放射性標記探針等技術(shù)方面。其中放射性探針應用下，盡管對于寡核苷酸、RNA或單鏈DNA等都可進行標記，但其涉及的同位素具有較高的成本，很容易危害人體健康，所以使用中受到較大的限制。而對于熒光原位，應用中一般可做好細菌空間位置標識或定量定性判斷細菌情況等工作。另外，在核酸印跡方面，其適用對象集中表現(xiàn)在PCR擴增產(chǎn)物方面，對微生物風度、多樣性檢測都可起到重要作用[2]。

2環(huán)境工程微生物領(lǐng)域中分子生物技術(shù)的應用分析

2.1微生物群種豐度與多樣性的分析

現(xiàn)行環(huán)境工程領(lǐng)域中，通常需檢測的對象多表現(xiàn)在底泥、土壤、生物膜以及污泥方面。從現(xiàn)行較多實踐研究都可發(fā)現(xiàn)，若將16SrRNA從菌落中提取出來并開展測序工作，可對微生物種群在活性污泥中的情況被測定，并將聚光激光掃描、熒光顯微以及FISH等技術(shù)引入，可定位生物膜中的微生物或檢測其活性。再以城市地區(qū)垃圾填埋細菌的分析，可在ARDRA方法的運用下，使細菌多樣性情況以及細菌結(jié)構(gòu)被有效判斷。這些都可充分說明微生物豐度、多樣性都可在分子微生物技術(shù)應用下被有效判斷，通過定量或定性檢測得到的結(jié)果，能夠為環(huán)境工程中較多工藝操作、構(gòu)筑物設(shè)計提供參考。

2.2指示微生物與致病菌的有效檢測

環(huán)境工程研究中，可發(fā)現(xiàn)在土壤、水體或空氣等媒介作用下，致病菌很可能對人體造成較大威脅，如典型的SARS。對此，便可借助分子微生物完成致病菌測定工作，如部分學者將16SrRNA基因、PRC-DGGE技術(shù)共同引入，對垃圾場、污水處理廠以及大學校園中的空氣環(huán)境進行測定，可發(fā)現(xiàn)在以往微生物培養(yǎng)下，很難測定氣溶膠微生物情況。另外，對于水體內(nèi)是否有大腸桿菌等DNA存在，也可借助分子微生物技術(shù)進行判斷。這些都可充分說明，對于指示微生物、致病菌的檢測，分子生物技術(shù)應用效果都較為明顯。

2.3功能微生物的培養(yǎng)

由于當前化工行業(yè)發(fā)展步伐較快，其帶來的過多有機化合物也成為環(huán)境工程領(lǐng)域面臨的難題，很多有機化合物如含苯環(huán)類型，很難實現(xiàn)快速降解目標。對此問題，大多學者通過實驗方式，發(fā)現(xiàn)分子生物技術(shù)應用下可使這種現(xiàn)狀得以改變，如對甲苯質(zhì)粒、降解萘利用DNA印跡雜交形式，可使這兩種質(zhì)粒微生物被判斷。此外，對于其他難以降解的有機物，都可采用質(zhì)粒如工程、基因重組等方式，使功能群被構(gòu)建，使有機物難以被降解的問題得以解決[3]。

3結(jié)論

分子生物技術(shù)的應用是現(xiàn)行微生物研究的重要保障。實際引入該技術(shù)中，應正確認識分子生物技術(shù)的實現(xiàn)原理，包括測序技術(shù)、基因探針以及核酸技術(shù)等，在此基礎(chǔ)上將其融入致病菌檢測、功能微生物培養(yǎng)以及微生物多樣性分析等方面，能夠推動環(huán)境工程微生物學的進一步發(fā)展。

參考文獻

[1]石琛,王璐.環(huán)境微生物領(lǐng)域分子生物技術(shù)的應用進展[J].中國科技信息,2013,16:135+139.

[2]張鳳.在環(huán)境工程微生物領(lǐng)域中分子生物技術(shù)的應用[J].綠色科技,2013,08:192-194.

第4篇：微生物多樣性分析方法范文

[論文摘要]：對細菌分類學研究的目的簡單論述。對分類學研究中的多相分類方法包括經(jīng)典分類，化學分類，分子分類，數(shù)值分類進行了詳細的介紹，從而為臨床和科研中細菌鑒定方法的選擇應用提供參考依據(jù)。同時對分類學發(fā)展的研究趨勢進行了簡單的總結(jié)。

1.細菌分類學研究的目的

原核微生物系統(tǒng)分類是科學地研究微生物多樣性及它們之間相互關(guān)系的基礎(chǔ)學科[1]。細菌是原核微生物的重要成員，當前主要從兩個方面進行細菌分類學的研究，一是為了實用的需要，建立各種細菌的信息庫，從而更有效地開發(fā)利用細菌資源及有效地控制有害細菌。許多種細菌是微生物藥物活性物質(zhì)的重要來源。包括假單胞菌屬(Pesudomonas)、微球菌屬(Microcoeeus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Eneturbacetrium)和別單胞菌屬(Atleromonas)等。早在1966年，Burkholder從含溴假單胞菌分離到抗生素硝吡咯菌素(Pyornlirtin)[2]。二是建立反映細菌進化關(guān)系的自然分類系統(tǒng)，以揭示各種細菌的本質(zhì)特征和相互關(guān)系，豐富生物多樣性研究的內(nèi)容。

2.細菌分類學研究方法

多相分類法是目前廣泛使用的細菌分類學方法。在方法學上主要包括以下幾種。

2.1經(jīng)典分類

經(jīng)典分類主要指依據(jù)形態(tài)特征和生理生化特征等表觀分類學指征進行分類學研究，是多相分類研究的基礎(chǔ)。

2.2化學分類

化學分類是根據(jù)生物細胞中某些特定化學物質(zhì)的特征對生物個體進行分類的方法，是細菌屬劃分的主要特征之一。目前常使用的化學指征包括以下幾種。

2.2.1磷酸類脂分析

磷酸類脂與蛋白質(zhì)、糖等共同構(gòu)成細胞膜，對于物種運輸、代謝及維持正常的滲透壓都有重要作用。具有分類學意義的磷酸類脂是：PE、PC、PME、PG和GluNus等五種。

2.2.2脂肪酸組分分析

脂肪酸的鏈長、雙鍵位置和數(shù)量及取代基團在細菌中具有分類學意義。脂肪酸定性分析結(jié)果限于屬和屬以上的分類；脂肪酸定量分析結(jié)果可為種和亞種分類提供有用的基本資料。

2.2.3全細胞蛋白電泳分析

高度標準化的SDS-PAGE是對大量密切相關(guān)菌株進行比較歸類的有效方法，研究證明全細胞蛋白組分和DNA-DNA雜交有很好相關(guān)性[3]。此法用于種或種以下分類單位的研究。

2.3分子分類

分子分類是在分子水平上對生物個體的DNA、RNA和蛋白質(zhì)進行研究分類的方法。目前經(jīng)常使用的分子指征包括以下幾種。

2.3.1G+Cmol％測定

G+Cmol％主要用于驗證已建立的分類關(guān)系是否正確。通常認為：種內(nèi)菌株間G+Cmol％相差不超過4％，屬內(nèi)菌株間相差不超過10％。

2.3.2DNA同源性分析

分析DNA同源性的有效手段是DNA-DNA雜交，適用于種水平的分類學。1987年，國際系統(tǒng)細菌學委員會規(guī)定，DNA同源性≥70％為細菌種的界限。DNA-DNA雜交常用的方法有液相復性速率法和固相膜雜交等。

2.3.3DNA為基礎(chǔ)的分型方法

以DNA為基礎(chǔ)的分型方法指可將種分為不同型的技術(shù)。其中早期的RFLP，缺點是圖譜復雜，難于比較。選用專一識別6－8個堿基序列的限制性內(nèi)切酶，DN段數(shù)量就大大減少的LFRFA被認為是目前分辨率最高的DNA分型法之一。但這樣切出的DN段太大，只能用脈沖場凝膠電泳分開。RAPDA、ARDRA、AFLP等技術(shù)多用于種水平的研究。

rep-PCR所采用的分類信息來自于全基因組。該方法分辨率高、重現(xiàn)性好，在一定程度上與16SrRNA基因序列比較結(jié)果相一致，可作為一種快速鑒定的方法[4]。

2.3.4rRNA同源性分析

現(xiàn)在一般認為，rRNA是研究系統(tǒng)進化關(guān)系的最好材料。它廣泛存在，功能穩(wěn)定，由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成。最初人們通過rRNA-DNA雜交和寡核苷酸編目法間接研究rRNA的同源性。DNA-rRNA雜交反映的是屬與屬以上水平的信息[5]。

研究rRNA同源性最直接可靠的方法是rRNA核苷酸序列分析。目前，以16SrRNA序列分析的應用最為廣泛。

2.3.5特異引物PCR

16SrRNA特異引物的設(shè)計是建立在大量序列分析基礎(chǔ)之上的。若能設(shè)計出一系列特異引物，如屬特異引物，則菌種篩選過程將大為簡化。種特異的引物主要用于鑒定，結(jié)合屬特異引物聯(lián)合應用則可能發(fā)現(xiàn)新種。

3.細菌分類學發(fā)展的研究趨勢

今后細菌分類學的發(fā)展將集中于以下幾個方面：

(1)分析方法的標準化

有研究表明，細菌的脂肪酸、磷脂與醌類組成及含量隨著培養(yǎng)條件的變化而不同[71]。所以化學分類必須建立標準化的方法，這樣定量才有意義，更準確，更具可比性。

(2)多相分類方法的廣泛應用及分子分類法的發(fā)展

由于各種分子生物學技術(shù)方法在分類學中的應用，細菌分類學家的研究重點已不僅是對某個分類單元的分類鑒定，而是通過分子分類的方法把分類與進化緊密的結(jié)合起來。在未來幾年內(nèi)16SrDNA/rRNA作為重要的系統(tǒng)發(fā)育分子仍將發(fā)揮主導作用，但是其它保守分子將更多的用于系統(tǒng)發(fā)育研究，如RNA聚合酶P,HSP60基因，延伸因子Tu,23SrDNA/rRNA,rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)等。

(3)“在線分類”的發(fā)展

現(xiàn)代細菌分類研究越來越依賴于Internet，我們不僅需要大量的分子生物學和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件，更離不開網(wǎng)上豐富的信息資源。因此，Oren和Stackebrandt于2002年提出了原核生物“在線分類”(onlinetaxonomy)的概念[6]。

(4)分類學研究與細菌資源研究結(jié)合

很多科研單位己注意到將系統(tǒng)分類與細菌資源的開發(fā)研究相結(jié)合，例如日本的北理研究所、理化研研究所、明治制藥等。

參考文獻

[1]宋延齡,楊親二,黃永青.物種多樣性研究與保護[M].浙江科學技術(shù)出版社,1998.

[2]BurkholderPR,PfisterMR,LeitzHF.ProductionofapyrroleantibioticbyaMarinebaeterium.AppliedMierobial,1966,14:649-653.

[3]Kersters,K.,Pot,B.,Dewettinck,D.,etal.Indentificationandtypingofbacteriabyproteineletrophoresis.In：PriestPG,Ramos-CormenzanaA,andTyndallBed.Bacterialdiversityandsystematics.NewYork：PlenumPress,1994.

[4]張建麗,劉志恒.鏈霉菌的rep-PCR基因指紋分析.微生物學報,2004,44(4):281-285.

第5篇：微生物多樣性分析方法范文

關(guān)鍵詞: 香蕉；內(nèi)生細菌；DGGE；群落結(jié)構(gòu)；多樣性

中圖分類號：S668．1 文獻標志碼：A 文章編號：1009－9980（2012）02－0235－06

Analysis of entophytic bacteria community structure in banana by PCR-DGGE technique

LIU Fei-fei，LI Chi*，LIU Yong-qin，YU Li

（College of Agriculture， Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088 China）

Abstract: The total genomic DNA was extracted from various tissues of both the healthy bananas and the ones which were infected with Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）. Then the 16Sr DNA V3 fragment polymerase chain reaction products amplified from the total genomic DNA were analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）. The results of sequence analysis of the 18 DGGE dominant bands showed that the population abundance of endophytic bacteria contained in the healthy banana plants and the infected plants was different. The most abundant population was found in roots ，the middle in the bulb tissue and the least in leaves; The abundance of endophytic bacteria increased after infection with FOC; And most of the sequences were phylogenetically close to Cyanobacteria， Chloroflexi， Actinobacteria， Proteobacterium， Bacteroidetes， Firmicutes and Chlorobi； But the homology for one of the sequences was only 91%. It may represent a new taxon.

Key words： Banana； Entophytic bacteria； Denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）； Community structure； Diversity

植物內(nèi)生細菌是一類在健康植物棲居，對植物無害并與植物建立和諧關(guān)系，廣泛存在于植物根、莖、葉、花、果實和種子等器官中的微生物群落[1]。植物內(nèi)生細菌具有宿主特異性，同一宿主植物的不同器官、生育期及宿主所處的環(huán)境條件的不同，其內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)也不同[2]。目前，內(nèi)生細菌的研究主要集中在內(nèi)生細菌的分離鑒定、植物病害的生物防治、對宿主植物的促生作用以及內(nèi)生細菌種群多樣性研究等領(lǐng)域[3-5]。在研究方法上以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法為主，但是由于培養(yǎng)條件的限制，可培養(yǎng)細菌種群數(shù)量僅占細菌總數(shù)0.1%~10%，90%以上的微生物不能進行人工培養(yǎng)[6]。所以，分離培養(yǎng)技術(shù)不能全面、準確反映微生物種群多樣性概況。PCR-DGGE技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種技術(shù)，在分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究中具有檢測極限低，分離快速、簡便、重復性好和同時分析多個樣品的優(yōu)點。目前PCR-DGGE技術(shù)在濕地[7]、污水[8]、海洋[9]等領(lǐng)域微生物多樣性的研究應用比較廣泛，在植物內(nèi)生微生物多樣性的研究中也有應用[10]。

在香蕉內(nèi)生細菌多樣性的研究中，國內(nèi)付業(yè)勤等[11]對健康香蕉植株可培養(yǎng)細菌進行了研究，明確了可培養(yǎng)細菌在香蕉植株不同器官中的數(shù)量分布，不動桿菌屬（Acinetobacter）等9種內(nèi)生細菌對香蕉枯萎病菌有抑制作用。潘羨心用16S rDNA序列分析法證明了香蕉根部具有豐富的內(nèi)生細菌[12]。我們采用非培養(yǎng)方法，利用PCR-DGGE分子生物學技術(shù)，研究香蕉內(nèi)生細菌群落多樣性，揭示香蕉不同器官健株與病株組織內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)的差異，對了解香蕉和開發(fā)新的微生物資源具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌種: 2009年從湛江硇洲島采集香蕉枯萎病害標本，經(jīng)過分離、鑒定，獲得的純化菌株Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC），菌株編號HMGDOU40928，保存在廣東海洋大學植?？萍贾行?。

供試香蕉苗: 香蕉苗株高30~40 cm，5~6片葉子，品種為巴西蕉。

1.2 主要試劑

DNA marker、DNA Taq 聚合酶、DNA純化試劑盒、pMD18-T載體試劑盒、大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞，購自TAKARA；PCR引物338F-GC、518R、338F、M13-47和M13-48，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 香蕉苗接種及表面消毒

香蕉苗進行傷根接種[13]，孢子濃度為106 cfu?mL-1，每個處理香蕉苗30株，以無菌水為空白對照。各處理的香蕉苗，置室溫常規(guī)盆栽。40 d后的香蕉苗根莖葉各組織進行表面消毒處理[14]，同時將最后一次沖洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h，檢測表面滅菌效果，然后用于提取植株組織總DNA。

1.4 組織總DNA提取與純化

參照沈洪等[15]改良的CTAB法提取香蕉根部、假莖、葉片的總DNA。總DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以Hind III DNA Marker做分子質(zhì)量DNA，用Gel Red染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad GelDoc XR+）中觀察，拍照。

1.5 16S r DNA V3區(qū)PCR的擴增

以降落式PCR[16]擴增細菌16S rDNA的V3區(qū)片段。選擇細菌的16S rDNA的V3區(qū)通用引物338F-GC（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和518R（5’-ATTACCGCGGCTG CTGG-3’），提取得到的總DNA適當稀釋后做模板進行PCR。PCR體系: 10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL（2.5 mmol?L-1），引物各1 μL（10 μmol?L-1），模板DNA 2 μL，Taq酶 0.5 μL（5 U?μL-1），加雙蒸水至50 μL。PCR反應條件: 94 ℃變性10 min，94 ℃變性1 min，65 ℃（-1 ℃/循環(huán)）退火1 min，72 ℃延伸2 min，共10個循環(huán)，然后94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共20個循環(huán)，最后再72 ℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，后用于DGGE分析。

1.6 各組織的DGGE電泳及圖譜分析

DGGE（南京，DGGE-1102）條件為: 聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為1×TAE，設(shè)置凝膠變性梯度為45%~70%[17]，每孔上樣量為20 μL PCR產(chǎn)物與8 μL 10×加樣緩沖液。電泳溫度為60 ℃，A段電泳電壓60V，45 min，B段電泳電壓120V，10 h。銀染后拍照分析。

所得的DGGE圖譜用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0軟件處理，對各個組織樣品條帶進行分析。根據(jù)各個樣品在DGGE圖譜中的顯示，對其相似性進行聚類分析，來比較各樣品中的細菌落結(jié)構(gòu)和多樣性。

1.7 DGGE條帶克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析

將優(yōu)勢條帶進行切膠回收，4 ℃無菌水中浸泡過夜。以上清液為模板，引物338F（不帶GC夾子）和518R進行16S rDNA V3區(qū)的PCR擴增，擴增產(chǎn)物用純化試劑盒進行純化。純化后的產(chǎn)物與pMD18-T載體16 ℃連接3 h，再用熱激法轉(zhuǎn)化進大腸桿菌 DH5感受態(tài)細胞。在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，篩選出具有氨芐青霉素抗性的白色菌落轉(zhuǎn)化子。利用載體通用引物M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）和M13-48（5’-AGCGG ATAACAA TTTCACACAGGA-3’）進行菌落PCR檢測，篩選出陽性菌落后，進行搖菌培養(yǎng)，送到上海博尚生物技術(shù)有限公司測序。

序列通過分析比對后去掉載體序列提交到Gen Bank進行blast比對。選出同源性最高的序列作為參照菌株，用軟件Clustal X比對后，用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總DNA的提取和16Sr DNA V3區(qū)的擴增

采用改良后的CTAB方法提取香蕉組織樣品的總DNA，具有較為完整的細菌基因組DNA。且最后一次淋洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h，無菌落生長。選擇細菌的16S rDNA的V3區(qū)通用引物338F-GC和518R對純化后的各樣品的總DNA進行PCR擴增，所得到的DN段均為單一條帶（圖1），片段大小約為180 bp，說明擴增產(chǎn)物無明顯的非特異性擴增現(xiàn)象。

2.2 DGGE的圖譜及分析

對香蕉植株在感染FOC前后各組織內(nèi)生細菌的種群多樣性的DGGE圖譜（圖2-I）采用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0軟件進行分析，結(jié)果見圖2-II。

從DGGE電泳圖譜中可以看出植株各組織中內(nèi)生細菌種類豐富，且差異性較大。健株的根、莖、葉組織中至少存在22、20和15種不同的內(nèi)生細菌，病株中至少存在30、27、24種，且感病植株內(nèi)生菌種類明顯比健康植株豐富。1號、2號等條帶較亮，代表健康植株和發(fā)病植株中均存在的優(yōu)勢菌種。5號為病株根部特有條帶，9號、11號、13號為病株假莖特有條帶，17號為病株葉片特有條帶（圖2-I）。

不同組織樣品間條帶的異同，反映了組織之間細菌群落的相似性和差異性。表1列出了各樣品之間內(nèi)生細菌相似性結(jié)果: 各樣品間的細菌群落相似性系數(shù)各不相同；同一植株不同組織相似性系數(shù)差異性顯著，根、莖、葉內(nèi)生細菌群落相似性系數(shù)都依次降低，健株分別為66.9%、55.0%、43.6%，病株為70.3%、58.0%、46.2%。健株和病株的同類組織的相似性系數(shù)較高，根、莖、葉組織內(nèi)生菌相似性系數(shù)分別為75.5%、78.9%、72.0%。

2.3 優(yōu)勢條帶的系統(tǒng)發(fā)育分析

將DGGE圖譜上比較亮的18個條帶進行回收、克隆、測序，所得序列大小為180 bp左右。通過用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫序列比對分析，17個條帶所測序列與數(shù)據(jù)庫中序列相似性在94%~100%（表2），分別歸屬于藍細菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形桿菌門（Proteobacterium）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠菌門（Chlorobi） 7大類；另外，4號條帶序列與GenBank登陸號為GQ243083的Proteobacterium關(guān)系最為密切，相似率只有91%，推測香蕉內(nèi)生細菌群落中可能存在新的種群。

從系統(tǒng)發(fā)育樹可見，7個序列歸屬于藍細菌門Cyanobacterium，占所測序列的38.9%，相似性在98%~100%。7號條帶為擬桿菌門的新鞘氨醇桿菌屬Novosphingobium sp.，是18個陽性克隆中唯一的可培養(yǎng)細菌。絕大多數(shù)為不可培養(yǎng)細菌，占94.4%。由圖2-I分析出，1號和2號比較亮的條帶分別與放線菌屬（Actinomyces sp.）、綠彎菌門（Chloroflexi）同源性較高，2者是健康與發(fā)病的香蕉植株都存在的優(yōu)勢菌群。

3 討 論

在研究植物內(nèi)生細菌時，為避免表面其他微生物的污染，減少腐生細菌DNA殘留問題[15]，應對材料進行嚴格的表面消毒，盡量取植物的內(nèi)部組織進行總DNA的提取，同時將最后一次沖洗水進行涂平板檢測表面消毒效果，直到培養(yǎng)至無菌落出現(xiàn)為止，這樣才能保證DGGE電泳產(chǎn)生的條帶能反應出組織內(nèi)生細菌種群的多樣性。

內(nèi)生細菌在香蕉根、假莖、葉片中的菌落豐富度和種群數(shù)量存在差異。各組織中細菌豐富度為根部>假莖>葉片，呈遞減趨勢，根部內(nèi)生細菌數(shù)量最豐富，與羅明等[18]文獻研究結(jié)果一致。這可能與土壤中棲息著豐富的細菌種類并可以進入香蕉根部有關(guān)。從DGGE電泳圖譜中可以看到感病植株組織內(nèi)生菌種類比健康植株豐富，與王愛華等[19]研究結(jié)果一致，可能與植株感病后的自身抵抗力降低，細菌容易侵入有關(guān)。同一植株根、假莖和葉片內(nèi)生細菌群落相似性系數(shù)依次降低，推測大部分內(nèi)生細菌群落是由根向莖再向葉擴展分布的，也就是說內(nèi)生細菌可能是種苗攜帶或者通過根部侵入。

研究表明細菌數(shù)量超過群落細菌數(shù)量1%才可以通過PCR-DGGE檢測出來[20]，因此系統(tǒng)中的弱勢菌群有可能被漏檢，所以香蕉植株具有豐富的內(nèi)生細菌資源并可能存在未被認知的新物種。對18條帶進行切膠回收并克隆測序，分別屬于7個細菌類群，其中變形桿菌門（ Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）類群與脹果甘草內(nèi)生細菌的菌群比較相似[21]。放線菌是一類重要的生防菌類群，曹理想等[22]用傳統(tǒng)分離方法研究香蕉內(nèi)生放線菌和真菌多樣性，共分離156株內(nèi)生放線菌，優(yōu)勢菌株與本研究結(jié)果不同，本研究所測序得到的放線菌類中是否存在香蕉枯萎病菌的拮抗放線菌，仍需深入研究。綠彎菌門（Chloroflexi）等幾個類群均為不可培養(yǎng)細菌[23]，香蕉內(nèi)生細菌研究中還未見報道。在所得香蕉植株內(nèi)生細菌中，藍細菌門Cyanobacteriu的有關(guān)菌占35%，為優(yōu)勢菌群。研究中發(fā)現(xiàn)香蕉植株發(fā)病后所出現(xiàn)的特征條帶，分別為5、9、11、13和17號帶，這些特有條帶80%為藍細菌門（Cyanobacteri）的細菌。有報道稱藍細菌與蘇鐵[24]、小葉滿江紅[25]等低等植物形成共生固氮體系，藍細菌與香蕉的相互關(guān)系還未見報告。藍細菌門（Cyanobacteri）、變形桿菌門（ Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、綠菌門等不可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的作用及與寄主植物之間的相互關(guān)系，還有待進一步研究。

PCR-DGGE方法研究植物內(nèi)生細菌多樣性，初步揭示香蕉植株感染枯萎病菌前后的內(nèi)生細菌的種類以及不同組織種類的變化情況。這種PCR-DGGE的方法可用于確定不能進行純培養(yǎng)的內(nèi)生細菌的種類，與以往分離培養(yǎng)直接形態(tài)觀察的方法相比，擴大了人們對內(nèi)生細菌的研究視野，豐富了內(nèi)生細菌資源，可以提供更多的內(nèi)生細菌種群信息。DGGE的方法有助于深入了解病原菌與內(nèi)生細菌之間在寄主植物中相互作用的關(guān)系，從而為植物病害的防治提供新的思路。

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第6篇：微生物多樣性分析方法范文

2002年召開的《生物多樣性公約》第六次締約方大會上通過的VI/7A號決定，要求各締約方制定關(guān)于把與生物多樣性相關(guān)問題納入環(huán)境影響評估及戰(zhàn)略環(huán)境評估立法或進程的準則[1]。2006年召開的《生物多樣性公約》第八次締約方大會上通過了“關(guān)于涵蓋生物多樣性各個方面的影響評估的自愿性準則”的第VIII/28號決定[2]。我國是最早簽署《生物多樣性公約》的國家之一，政府積極采取措施履行公約規(guī)定的義務。2003年9月1日起施行《中華人民共和國環(huán)境影響評價法》（以下簡稱《環(huán)評法》），首次提出對規(guī)劃進行環(huán)境影響評價。要求“國務院有關(guān)部門、設(shè)區(qū)的市級以上地方人民政府及其有關(guān)部門，對其組織編制的土地利用的有關(guān)規(guī)劃，區(qū)域、流域、海域的建設(shè)、開發(fā)利用規(guī)劃，應當在規(guī)劃編制過程中組織進行環(huán)境影響評價，編寫該規(guī)劃有關(guān)環(huán)境影響的篇章或者說明”；“對工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、林業(yè)、能源、水利、交通、城市建設(shè)、旅游、自然資源開發(fā)的有關(guān)專項規(guī)劃，應當在該專項規(guī)劃草案上報審批前，組織進行環(huán)境影響評價，并向?qū)徟搶ｍ椧?guī)劃的機關(guān)提出環(huán)境影響報告書”。這就意味著國家正式把針對規(guī)劃的戰(zhàn)略環(huán)境評價放在了重要位置[3]。2009年10月1日起施行的《規(guī)劃環(huán)境影響評價條例》（以下簡稱《條例》），是在《環(huán)評法》的法律框架下，從規(guī)范管理的角度出發(fā)，對法律不明確之處予以明確，對法律的原則規(guī)定予以細化，通過進一步完善規(guī)劃環(huán)評程序，明確實施主體，落實相關(guān)方的法律責任、權(quán)力和義務。《條例》的出臺，表明國家對規(guī)劃環(huán)境影響評價的執(zhí)法力度將進一步加強[4]。其中直接歸屬農(nóng)業(yè)部門的有農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)專項規(guī)劃，涉農(nóng)的有土地、區(qū)域、流域、海域等有關(guān)規(guī)劃。2010年9月環(huán)保部發(fā)文“中國生物多樣性保護戰(zhàn)略與行動計劃（2011—2030年）”，在條目五“生物多樣性保護優(yōu)先領(lǐng)域與行動”中設(shè)立優(yōu)先領(lǐng)域二“將生物多樣性保護納入部門和區(qū)域規(guī)劃，促進持續(xù)利用”，要求“開展生物多樣性影響評價試點”[5]。我國是生物多樣性大國，生物多樣性居世界第八位。我國又是世界上人口最多、約85%左右的人口在農(nóng)村的農(nóng)業(yè)大國，對生物多樣性具有很強的依賴性。農(nóng)業(yè)部門制定的農(nóng)業(yè)規(guī)劃以及其他部門制定的涉農(nóng)規(guī)劃，絕大部分是在農(nóng)區(qū)實施的。農(nóng)區(qū)是由原本豐富多樣的生物地理就界開發(fā)而來，農(nóng)區(qū)邊際土地仍然是生物多樣性相對富集的區(qū)域，農(nóng)區(qū)生物多樣性也是國家生物多樣性的重要組成部分。開展農(nóng)業(yè)規(guī)劃環(huán)評生物多樣性影響評價是農(nóng)區(qū)生物多樣性保護與管理的基礎(chǔ)，也是環(huán)評不可缺少的內(nèi)容。

2生物多樣性影響評價基本內(nèi)涵與主要內(nèi)容

2.1基本內(nèi)涵

生物多樣性保護是生態(tài)和環(huán)境保護的核心內(nèi)容之一，而環(huán)境影響評價是從源頭保護生物多樣性的重要途徑。農(nóng)業(yè)規(guī)劃環(huán)評中生物多樣性影響評價的基本內(nèi)涵就是：農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施對規(guī)劃區(qū)域的遺傳多樣性、物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性和景觀多樣性可能帶來的影響進行分析、預測與評估，提出避免、預防或減輕不良影響的對策和措施，建立監(jiān)測機制并跟蹤評價，持續(xù)改進達到保護目的。

2.2主要內(nèi)容

農(nóng)業(yè)規(guī)劃生物多樣性影響評價的主要內(nèi)容有4方面：

（1）分析預測規(guī)劃實施可能會影響到實施區(qū)域生物多樣性的哪些方面。關(guān)于生物多樣性影響評價的分析尺度，目前比較公認的是遺傳多樣性、物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性。隨著景觀生態(tài)學的發(fā)展，將景觀生物多樣性納入生物多樣性保護的層次；

（2）對影響可能造成的后果加以評價包括短期影響、長期影響、直接影響、間接影響、累積影響等，影響是否有利，是否可恢復等。

（3）針對生物多樣性各層次的影響，需要采取哪些預防和保護措施；

（4）建立長期監(jiān)測生物多樣性的機制，跟蹤和預測生物多樣性的變化趨勢。

3農(nóng)業(yè)規(guī)劃環(huán)境影響評價中生物多樣性影響評價基本程序

根據(jù)農(nóng)業(yè)規(guī)劃環(huán)評中生物多樣性影響評價的基本內(nèi)涵，其基本程序包括規(guī)劃分析、現(xiàn)狀調(diào)查與分析、影響要素識別、影響預測與評價、預防和保護措施、監(jiān)測與跟蹤評價等。

3.1規(guī)劃分析

規(guī)劃分析首先是規(guī)劃的協(xié)調(diào)性分析，規(guī)劃協(xié)調(diào)性分析可以幫助了解規(guī)劃政策背景[6]，分析規(guī)劃與相關(guān)政策法規(guī)的一致性、與產(chǎn)業(yè)政策的符合性、與國家及地方有關(guān)規(guī)劃的符合性，同時避免不同部門、不同層次間規(guī)劃缺少銜接以及沖突[7]。包括外部協(xié)調(diào)性分析和內(nèi)部協(xié)調(diào)性分析。外部協(xié)調(diào)性主要是分析規(guī)劃目標的合理性與限制性，內(nèi)部協(xié)調(diào)性是分析規(guī)劃界定的主要內(nèi)容之間是否存在沖突等。其次是分析規(guī)劃的有關(guān)內(nèi)容，包括規(guī)劃的編制背景、規(guī)劃的目標、規(guī)劃的對象、規(guī)劃的具體內(nèi)容、實施方案、實施范圍、實施期限等。第三是分析規(guī)劃的不確定性[8]。各級政府和部門編制的規(guī)劃其協(xié)調(diào)與銜接狀況對規(guī)劃的實施具有不確定性、規(guī)劃本身的遠期不確定性、規(guī)劃的具體項目的不確定性、污染物排放量的不確定性等。

3.2現(xiàn)狀調(diào)查與分析

根據(jù)生物多樣性的層次及保護需要，調(diào)查農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施區(qū)域生物多樣性歷史演替過程和現(xiàn)狀。重點調(diào)查分析以下區(qū)域的生物多樣性：（1）具有生態(tài)學意義的保護目標；（2）具有美學意義的保護目標；（3）具有科學文化意義的保護目標；（4）具有經(jīng)濟價值的保護目標；（5）重要生態(tài)功能區(qū)和具有社會安全意義的保護目標；（6）生態(tài)脆弱區(qū)；（7）人類建立的各種具有生態(tài)環(huán)境保護意義的對象等[9]。

3.3影響識別、預測與評估

生物多樣性影響識別是在分析農(nóng)業(yè)規(guī)劃目標及總體方案的基礎(chǔ)上，通過一定方法找出農(nóng)業(yè)規(guī)劃所確定的某個項目或活動對生物多樣性影響的各種變化指標，說明生物多樣性影響的性質(zhì)、程度及可能的影響范圍。影響識別主要包括以下3方面：（1）影響主體識別。識別農(nóng)業(yè)規(guī)劃的目標、指標和總體方案及其執(zhí)行主體，主要是可能給生物多樣性帶來影響的農(nóng)業(yè)規(guī)劃活動等具體的規(guī)劃實施內(nèi)容以及這些規(guī)劃實施內(nèi)容具體的執(zhí)行主體。（2）影響受體識別。識別規(guī)劃區(qū)域內(nèi)主要的生物多樣性資源：包括遺傳多樣性與重要農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源、物種與生境多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性，如自然保護區(qū)、風景名勝區(qū)、濕地、農(nóng)田、水土流失重點治理區(qū)等的組成結(jié)構(gòu)、面積和分布等；景觀多樣性，包括景觀類型多樣性、斑塊多樣性、景觀異質(zhì)性和穩(wěn)定性等。特別應了解該區(qū)域農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動的歷史與現(xiàn)狀、是否產(chǎn)生過或者現(xiàn)在仍然存在一些嚴重的生態(tài)問題，因為這些生態(tài)問題往往與生物多樣性直接相關(guān)。（3）影響效應識別。識別主體（農(nóng)業(yè)規(guī)劃）與受體（生物多樣性）的相互關(guān)系，確定農(nóng)業(yè)規(guī)劃對生物多樣性的顯著影響及關(guān)鍵影響因子。對生物多樣性影響的強度，關(guān)注影響發(fā)生的背景。影響強度包括影響范圍、影響過程和影響性質(zhì)（包括有利/不利、可逆/不可逆）；影響發(fā)生的背景包括產(chǎn)生地點、影響時間以及受影響者的具體情況。在上述影響識別的基礎(chǔ)上，結(jié)合規(guī)劃的總體目標及在不同的階段或期限予以實施的情況，預測規(guī)劃實施的不同階段或期限可能造成的生物多樣性影響并進行評估。

3.4預防措施與保護方案

由于農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施范圍較大，具有宏觀性，規(guī)劃環(huán)境影響評價的生物多樣性保護也需從大的范圍和宏觀上進行把握。制定具體的預防措施和保護方案，應依次按照預防措施、最小化措施、減量化措施、修復補救措施、重建措施序列原則進行[9]。物種及其生境（棲息地）是各層次生物多樣性表現(xiàn)形式和基礎(chǔ)，對于重要物種的保護要以就地保護為主，遷地保護為輔。物種與其生境具有不可分割的聯(lián)系，保護原生境及其里面的生物資源是保護生物多樣性及其資源永存的最符合自然規(guī)律的手段，也是“生態(tài)系統(tǒng)方法”的基本原理之一。遷地保護措施也很重要，但它是在原生境遭到嚴重破壞和就地保護已經(jīng)不可靠的情況下的輔助手段。

3.5監(jiān)測與跟蹤評價

由于生物多樣性影響的表現(xiàn)具有滯后性特點，應建立長期監(jiān)測機制，對生物多樣性保護目標動態(tài)變化進行跟蹤監(jiān)測，分析生物多樣性變化的趨勢，預防可能產(chǎn)生不良影響的因素，及時調(diào)整保護措施，確保生物多樣性保護的有效性。

4農(nóng)區(qū)生物多樣性影響評價層次及特點

農(nóng)業(yè)是一種直接利用生物多樣性的產(chǎn)業(yè)，包括直接利用生物多樣性的資源材料以及模擬生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)（植物種植業(yè)）和次級生產(chǎn)（動物養(yǎng)殖業(yè)）等全部生產(chǎn)過程；而且還包括進一步利用生態(tài)系統(tǒng)中的有機物腐解過程使之轉(zhuǎn)化為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物（食用菌養(yǎng)殖、微生物造肥、生產(chǎn)沼氣等）。考慮到農(nóng)業(yè)規(guī)劃主要是在農(nóng)區(qū)實施，這里的農(nóng)區(qū)不是僅局限于種植業(yè)區(qū)域的“小農(nóng)區(qū)”，是包括農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)活動范圍的“大農(nóng)區(qū)”，因此，就農(nóng)區(qū)和農(nóng)業(yè)而言，生物多樣性可分為農(nóng)區(qū)遺傳多樣性、農(nóng)區(qū)物種及生境多樣性、農(nóng)區(qū)生態(tài)系統(tǒng)多樣性、農(nóng)區(qū)景觀多樣性、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)多樣性幾個尺度水平[10-11]。

4.1農(nóng)區(qū)遺傳多樣性影響評價特點

遺傳多樣性是生物多樣性的基本組成部分，是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)。它通常被認為是種內(nèi)不同群體之間和一個群體內(nèi)不同個體之間的遺傳變異總和。遺傳多樣性是以物種為載體表現(xiàn)的，可以從形態(tài)特征、生理特征、細胞學特征、基因位點及DNA序列等不同方面來體現(xiàn)。農(nóng)區(qū)遺傳多樣性影響評價應主要關(guān)注：

（1）農(nóng)業(yè)活動使得生境破碎、消失引起物種種群縮小、消失導致遺傳多樣性喪失；

（2）外來物種入侵排擠當?shù)胤N，使得遺傳多樣性喪失；

（3）農(nóng)業(yè)新品種發(fā)展項目，對遺傳多樣性產(chǎn)生的影響；

（4）轉(zhuǎn)基因作物可能引起的遺傳多樣性的變化及喪失[12]。由于受科學研究的限制，在現(xiàn)實中只對少量的物種進行過比較全面的遺傳多樣性研究，在遺傳多樣性層次評估生物多樣性影響目前還不具有普遍意義。在環(huán)評工作中，建議把遺傳多樣性影響評價的內(nèi)容與物種多樣性、生態(tài)多樣性影響評價融合在一起描述，更易于操作。

4.2農(nóng)區(qū)物種及生境多樣性影響評價特點

在我國幾千年的農(nóng)業(yè)栽培和養(yǎng)殖實踐過程中，培育了大量食用與經(jīng)濟性能優(yōu)良的作物、果樹、家禽、家畜。我國栽培作物種和亞種有600多個，其中已知約237種為我國自古以來的土生栽培種，位居世界前列，被認為是世界三大農(nóng)業(yè)起源中心之一。其中糧食作物30多種，蔬菜200多種，牧草與飼料作物約400多種。果樹約300種，茶品種600多個，桑有15個種，共1000多個品種。家養(yǎng)動物品種和類群包括特種經(jīng)濟動物和家養(yǎng)昆蟲在內(nèi)，品種和類群有2000多個。除了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟物種外，在農(nóng)田、湖泊與河流等濕地生態(tài)系統(tǒng)及荒山草坡生態(tài)系統(tǒng)中還有大量野生動植物物種和類群。稻田中野生動物主要以兩棲類、爬行類動物和某些鳥類為主；重要雜草約有200多種。旱地生態(tài)系統(tǒng)中也生長著豐富的農(nóng)作物伴生物種，如有記錄的農(nóng)田雜草有73科、560多種，對農(nóng)作物有害的動物與昆蟲約1300多種，天敵生物近2000種，其中僅棉田的重要天敵蜘蛛就有21科、89屬、205種[11]。這些構(gòu)成了我國農(nóng)區(qū)物種及生境多樣性。在環(huán)評實際工作中，對農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施區(qū)域內(nèi)的物種及生境的全部評價是不現(xiàn)實的，也不符合農(nóng)業(yè)規(guī)劃環(huán)評宏觀性的特點。在滿足農(nóng)區(qū)生物多樣性保護要求下，物種及生境多樣性影響評價應針對區(qū)域關(guān)鍵物種及生境進行重點評價。

（1）保護物種。被國際、國家、地方、部門或保護組織明確列入保護名錄的物種。主要評價保護物種分布狀態(tài)、種群結(jié)構(gòu)及現(xiàn)存數(shù)量、保護級別、瀕危程度、生境特點、對環(huán)境的敏感程度、農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施對保護物種的影響程度、就地保護和遷地保。護實施的可行性等；

（2）地方特有種。其分布范圍狹窄、生境條件苛刻，當分布的區(qū)域環(huán)境改變，有可能造成這些物種滅絕。主要評價特有種的特有性（國際特有、國家特有、地方特有、區(qū)域特有）、瀕危程度、生境特殊性、受影響程度、就地保護和遷地保護實施的難易程度等；

（3）重要的農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源。是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動的基礎(chǔ)，關(guān)注其受保護的狀態(tài)，受影響程度，入庫保存情況；

（4）栽培和家養(yǎng)生物的野生近緣種和野生類型。起源于我國的栽培作物不僅種類多，而且具有野生近緣種的也多，它們是農(nóng)業(yè)生物多樣性的寶貴遺傳資源；家養(yǎng)生物的野生型是潛在進行品種改良的重要遺傳資源。這些遺傳資源的價值難以估量，在評價中應重點確認這些物種的存在、數(shù)量、生境條件、瀕危程度、受影響和潛在影響程度、保護措施等；

（5）其他物種，規(guī)劃實施區(qū)域受到較多關(guān)注的物種，具有文化及文物特點的物種等。

4.3農(nóng)區(qū)生態(tài)系統(tǒng)多樣性影響評價特點

我國農(nóng)區(qū)生態(tài)系統(tǒng)按其基本類型可以分為6類：農(nóng)田（水田與旱地）生態(tài)系統(tǒng)、種植園（水果、干果、蔬菜、茶葉、桑、藥材、花卉和其他特殊經(jīng)濟作物）生態(tài)系統(tǒng)、草原與草地生態(tài)系統(tǒng)、水產(chǎn)水域生態(tài)系統(tǒng)（陸地水域和海洋水域，與濕地生態(tài)系統(tǒng)基本類同）、集約化養(yǎng)殖場系統(tǒng)和農(nóng)區(qū)邊際土地生態(tài)系統(tǒng)[11]。農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施不確定性的特征，在對農(nóng)區(qū)生態(tài)系統(tǒng)多樣性影響的質(zhì)（影響性質(zhì)、影響類型、影響因素）和量（影響程度、時空規(guī)律、發(fā)生概率）上有更多不確定性。農(nóng)區(qū)生態(tài)系統(tǒng)多樣性影響評價主要是：

（1）生態(tài)系統(tǒng)類型結(jié)構(gòu)和功能完整性；

（2）生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性和整體變化趨勢；

（3）生態(tài)系統(tǒng)的服務功能及生態(tài)承載力；

（4）農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施可能的影響方式、范圍、強度和持續(xù)時間；

（5）受影響強度、范圍和持續(xù)時間，影響的結(jié)果是否有利、是否可逆；

（6）生態(tài)系統(tǒng)抗干擾的能力、恢復能力和生態(tài)系統(tǒng)的功能維系；

（7）預防與保護措施實施的可行性。

4.4農(nóng)區(qū)景觀多樣性影響評價特點

景觀多樣性是繼遺傳多樣性、物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性被提出的生物多樣性研究的第四個主要層次。這4個層次之間的關(guān)系依次為遺傳多樣性產(chǎn)生了物種的多樣性，物種多樣性與生境多樣性構(gòu)成了生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，多樣性的生態(tài)系統(tǒng)聚合并相互作用又構(gòu)成了景觀的多樣性。農(nóng)區(qū)景觀范圍多指大農(nóng)業(yè)或是整個農(nóng)業(yè)區(qū)域，因此對具有戰(zhàn)略定位的農(nóng)業(yè)規(guī)劃進行景觀多樣性影響評價是非常重要的。農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施對農(nóng)區(qū)景觀多樣性影響，主要關(guān)注（1）對景觀類型多樣性影響，景觀類型的分布面積和空間結(jié)構(gòu)等發(fā)生明顯變化、影響強度、指標物種瀕危程度、變化是否可恢復；（2）對景觀斑塊多樣性影響，鑲嵌地塊間生境的異質(zhì)性、連通性是影響生物多樣性的重要因素。農(nóng)區(qū)殘存的非農(nóng)作性生境，包括農(nóng)田邊際土地、島狀野生生境、灌木帶、林地、水塘、溝渠、荒地和休耕地等受影響的程度，這些生境破碎化程度，影響強度是否可逆；（3）對景觀格局多樣性影響，地塊內(nèi)物種的異質(zhì)性和共生性影響物種多樣性豐富程度。農(nóng)業(yè)活動方式變化、人為干擾強度、外源性物質(zhì)流入（農(nóng)用化學品等）、外源性遺傳物質(zhì)入侵（轉(zhuǎn)基因種植、外來物種入侵等）的影響。

4.5農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)多樣性評價特點

農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)多樣性用以描述包括農(nóng)、林、牧、副、漁各業(yè)的組成比例與結(jié)構(gòu)變化，它反映著某一區(qū)域農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的總體狀況，這也是農(nóng)業(yè)規(guī)劃中重要的篇章。應重點分析農(nóng)業(yè)規(guī)劃實施區(qū)域規(guī)劃實施前后，農(nóng)、林、牧、副、漁各業(yè)的組成比例與結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生的變化，這一變化對當?shù)厣锒鄻有钥赡墚a(chǎn)生的影響，分析影響的范圍、強度持續(xù)時間、是否有利、是否可逆等，重點評估當?shù)厣锒鄻有宰兓赡軒淼慕?jīng)濟價值變化。

第7篇：微生物多樣性分析方法范文

關(guān)鍵詞 退化喀斯特森林；喀斯特生態(tài)退化；生態(tài)恢復

中圖分類號 S718.55+1.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）02-0172-03

Abstract Karst forest refers to the forest climate background，the development of Karst landform on a fragile special forest ecosystem.The unreasonable development and utilization of human has led to a large area of Karst forest degradation.The paper introduced the definition of forest ecosystem degradation in Karst，Karst forest ecosystem degradation factors，restoration principles and theories，the recovery process，the recovery assessment and recovery technology were reviewed.

Key words degraded Karst forest；Karst ecological degradation；ecological restoration

我國分布有大量喀斯特（約3.443億km2），其中型喀斯特面積90.7萬km2，主要分布于貴州、 廣西、云南等西南地區(qū)。在南方喀斯特山地典型脆弱區(qū)中，貴州喀斯特面積最多，占全省土地面積的 73.8%[1-4]。隨著人口增加，資源開發(fā)，經(jīng)濟發(fā)展，以及人類的不合理開發(fā)利用，喀斯特森林大面積退化，甚至形成“石漠化”，嚴重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境乃至人類生存。由于生態(tài)環(huán)境問題對人類生存和社會的發(fā)展構(gòu)成了嚴重的威脅，已經(jīng)引起了當前國際社會上對生態(tài)環(huán)境安全越來越多的討論[5-6]?？λ固厣鷳B(tài)系統(tǒng)退化被學術(shù)界定為世界上主要的生態(tài)環(huán)境脆弱地區(qū)之一[7]。因此，對生態(tài)退化的研究，已經(jīng)成為各國政府和學者共同的關(guān)注，退化喀斯特森林的恢復與重建具有重要的理論意義和實現(xiàn)意義[8-10]。

1 喀斯特森林研究概況

國外對喀斯特森林的研究始于1973年 Le Grand在美國《科學》雜志上發(fā)表了關(guān)于喀斯特地區(qū)的森林退化及水文行為對喀斯特地區(qū)造成獨特的生態(tài)問題[11]。我國對森林生態(tài)系統(tǒng)恢復的研究，起步較早，研究的深度較廣。從1959年開始，研究人員在廣東沿海侵蝕地上開展了熱帶、亞熱帶退化生態(tài)系統(tǒng)恢復與重建[12-13]。相對于常綠闊葉林的研究而言，對我國退化喀斯特群落的研究較少，20世紀 40 年代郭魁士等開始對我國南方退化喀斯特群落進行研究[14]。80年代朱守謙在荔波茂蘭地區(qū)開展了喀斯特森林群落物種多樣性的初步研究，進入20世紀90年代，貴州大學、南京林業(yè)大學、貴州師范大學、中科院華南植物研究所相繼開展了對喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)的研究，其研究的焦點主要為喀斯特森林種群結(jié)構(gòu)及種群動態(tài)特征[15-17]、喀斯特森林的生境特征、對頂級群落特點的論述、喀斯特森林生物量、植被的多樣性、變化格局及分布格局，開展了對森林樹種的組成生長特點的研究以及討論了PV技術(shù)在樹木水分生態(tài)中的應用[18-24]。同時，吳興亮等對喀斯特森林真菌的種類組成及其生態(tài)分布作了研究[25]；張邦琨、龍翠玲等開展了對喀斯特森林土壤溫度及小氣候特征的研究[26-28]。喻理飛等將茂蘭地區(qū)演替系列各群落中所有的種劃分為5個適應等級種組，并提出以適應等級種組為相似元，種組重要值為屬性，頂極適應值為權(quán)重進行相似性分析，進行了退化喀斯特群落自然恢復過程的研究[29]。進入21世紀，張忠華等、俞國松等對喀斯特森林土壤養(yǎng)分的空間異質(zhì)性、其群落的種間分離特征進行了研究[30-31]；中科院華南植物研究所研究了地形和土壤因素對植物群落的分布影響，及通過長途基因傳播空間遺傳結(jié)構(gòu)的推斷對中國西南喀斯特森林瀕危樹種進行了研究[32-33]。同時期還有學者對喀斯特森林土壤微生物活性及土壤種子庫進行了研究[34-39]。最近幾年有學者就退化喀斯特森林自然恢復過程中的土壤進行了一系列的研究，其研究的焦點為喀斯特森林植被自然恢復過程中壤可礦化碳庫特征、土壤微生物數(shù)量、土壤肥力、土壤抗蝕性、物種多樣性的變化及恢復過程中的土壤生化作用及土壤有機碳庫特征[40-46]。學者喻理飛等提出了退化喀斯特森林自然恢復途徑并對自然恢復過程群落動態(tài)研究進行了評價[47-48]。

2 引起喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)退化因素

退化森林生態(tài)系統(tǒng)的實質(zhì)是森林生態(tài)系統(tǒng)的原有結(jié)構(gòu)被破壞并失去固有的平衡[49]，喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)退化受到以下因素的影響。

2.1 水分因素

喀斯特石漠化屬于喀斯特地區(qū)極嚴重的生態(tài)問題，喀斯特森林生境中普遍存在不同程度的水分虧缺。王家文等通過對不同的土壤表層含水量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的結(jié)果表明：干旱成為限制喀斯特森林植物生長的主要原因之一[50]。生境干旱是退化喀斯特森林的最顯著特點，對水分虧缺的適應是喀斯特樹種生存的前提[51]?？λ固氐貐^(qū)土層淺薄，蓄水保水能力差，極易形成季節(jié)性干旱[52]。

2.2 土壤養(yǎng)分和微生物

土壤是一定條件的水熱和生物作用下，成土母質(zhì)經(jīng)過物理、化學、生物過程形成的產(chǎn)物[53]。在不同氣候、地形、植被、人為干擾等許多自然、人為因素影響下，土壤理化性質(zhì)呈現(xiàn)綴塊性以及梯度格局[54-55]。土壤的空間異質(zhì)性在調(diào)節(jié)植物群落組成、植被分布、植被生物量格局上有重要影響[56]。提供養(yǎng)分是屬于土壤極為重要的生態(tài)功能之一，國內(nèi)研究人員在不同氣候區(qū)域、時空尺度分別研究了土壤養(yǎng)分空間異質(zhì)性與環(huán)境因子之間的關(guān)系，其中發(fā)現(xiàn)地形因子是導致土壤養(yǎng)分異質(zhì)，對植物分布產(chǎn)生影響的一個重要因素[57]。楊 珊等[58]研究了喀斯特石灰?guī)r、砂頁巖2種不同土地利用方式下土壤。其研究結(jié)果均證明了土壤養(yǎng)分差異對森林生態(tài)系統(tǒng)的退化會產(chǎn)生一定的影響。土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要分解者，在維持生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能方面起著十分重要的作用[59]。

土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要分解者，對森林生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動起到作用，利于維持生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能[60]。土壤微生物生物量碳的總量少，但卻影響著進入土壤的所有有機質(zhì)轉(zhuǎn)化，是土壤組成的精華，是生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分、能源循環(huán)的關(guān)鍵和動力[61-62]。土壤微生物有支持生態(tài)系統(tǒng)保持生產(chǎn)力的功能和調(diào)節(jié)喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)演替[63]。

2.3 植被因素

西南地區(qū)巖溶環(huán)境是一種典型的鈣生性環(huán)境，許多喜酸、喜濕、喜肥的植物難以生長，即使能生長也是長勢不良的“小老頭樹”。

2.4 資源不合理利用

喀斯特地區(qū)人口多，可耕地少，人均占有資源量少 。有資料記載大約在200年前，花江曾經(jīng)是一個森林茂密、土壤肥沃的地方。但隨著人類不合理的水土開發(fā)活動，現(xiàn)已不復存在。由于人地矛盾突出，人們對資源的不合理利用，毀林開荒，過度開墾，濫砍濫伐，牧地過度放牧，導致土壤退化，水土流失加劇，生態(tài)環(huán)境遭到嚴重破壞，原來茂密的喬灌木林，漸漸退化成了低矮的次生灌草叢林，甚至巖石，并最終導致該地區(qū)的生態(tài)環(huán)境退化[64]。

2.5 人為干擾

在喀斯特地區(qū)，由于人類對森林不合理的開發(fā)利用，使森林生態(tài)系統(tǒng)受到的人為干擾遠大于自然干擾[65]。彭少麟認為人為干擾是引起喀斯特森林普遍退化的重要原因[66]，導致喀斯特森林發(fā)生退化的人為干擾的主要形式是火燒、開墾、放牧和樵采，據(jù)喻理飛等對人為干擾對喀斯特森林群落退化的研究發(fā)現(xiàn)，不同的干擾形式對喀斯特森林產(chǎn)生的退化的影響程度不同，其中火燒對喀斯特森林的產(chǎn)生的退化的影響最大，其次是放牧，開墾和樵采[67]。

3 退化喀斯特森林的恢復與重建

3.1 恢復與重建的基本原則

生態(tài)恢復與重建的原則一般包括自然法則、社會經(jīng)濟技術(shù)原則和美學原則等3個方面[68]。退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復與重建要求必須建立在遵循自然規(guī)律的基礎(chǔ)。

3.2 退化喀斯特森林恢復的理論

岑慧賢等[69]認為干擾和演替是生態(tài)恢復與重建的理論基礎(chǔ)。彭少麟[70]認為，退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復與重建需要生態(tài)學理論的指導。任 海等[68]認為主要是演替理論，但遠不止演替理論，其核心原理是整體原理、協(xié)調(diào)與平衡原理、自生原理和循環(huán)再生原理。李明輝等[71]認為景觀生態(tài)學理論如景觀格局與景觀異質(zhì)性理論，干擾理論和尺度理論都能夠指導退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復實踐，是生態(tài)恢復與重建的新的理論基礎(chǔ)。

3.2.1 生態(tài)學基本理論。限制性因子原理：尋找生態(tài)系統(tǒng)恢復的關(guān)鍵因子；熱力學定律：確定生態(tài)系統(tǒng)能量流動特征；種群密度制約及分布格局原理：確定物種的空間配置；生態(tài)適應性理論：盡量采用鄉(xiāng)土種進行生態(tài)恢復；生態(tài)位原理：合理安排生態(tài)系統(tǒng)中物種及其位置；演替理論：縮短恢復時間，極端退化的生態(tài)系統(tǒng)恢復時，演替理論不適用，但具指導作用；生物多樣性原理：引進物種時強調(diào)生物多樣性，生物多樣性可使恢復的生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定；綴塊―廊道―基底理論：從景觀層次考慮生境破碎化和整體土地利用方式[12]。

3.2.2 自我設(shè)計與人為設(shè)計理論。自我設(shè)計與人為設(shè)計理論是唯一從恢復生態(tài)學中產(chǎn)生的理論，該理論是 Vander Valk[72]提出的。自我設(shè)計理論認為：只要有足夠的時間，隨著時間的進程，退化生態(tài)系統(tǒng)將根據(jù)環(huán)境條件合理地組織自己，并會最終改變其組分。人為設(shè)計理論認為：通過工程方法和植物重建可直接恢復退化生態(tài)系統(tǒng)，但恢復的類型可能是多樣的。這一理論把物種生活史作為植被恢復的重要因子，并認為通過調(diào)整物種生活史方法可以加快植被恢復。這2種理論不同點在于：自我設(shè)計理論把恢復放在生態(tài)系統(tǒng)層次考慮，未考慮到缺乏種子庫的情況，其恢復的只能是環(huán)境決定的群落；而人為設(shè)計理論把恢復放在個體或種群層次上考慮，恢復的可能是多種結(jié)果[73]。

3.3 退化喀斯特森林恢復的過程

自然恢復的本質(zhì)是群落演替[4]，喻理飛等的研究表明，喀斯特森林的退化是由頂極常綠闊葉林―喬林―灌喬林―灌木灌叢林―灌草群落―草本群落的逆向演替的過程，退化生態(tài)系統(tǒng)一旦停址干擾，便發(fā)生進展演替，向原群落方向發(fā)展，自然恢復過程是由先鋒種經(jīng)過渡種最終為頂極種替代的發(fā)展過程，恢復總是向結(jié)構(gòu)更復雜、功能更完善的方面發(fā)展。退化喀斯特森林在恢復過程中群落的氣候、土壤、組成、結(jié)構(gòu)、生物量均會發(fā)生變化[74]。

盧永飛與李安定等對群落的氣候變化研究表明：退化喀斯特森林在不同恢復階段中群落的光照、氣溫、空氣濕度、空氣中CO2濃度等氣候特征會發(fā)生變化[75-76]。通過對近幾年退化喀斯特森林恢復過程中群落的動態(tài)研究的文獻查閱發(fā)現(xiàn)對退化喀斯特森林恢復過程中土壤的變化的相關(guān)研究較多，退化喀斯特植被恢復過程中土壤微生物數(shù)量、土壤含水量及土壤酶活性的變化均為裸地階段喬木疏林>人工林>草坡>坡耕地，坡耕地土壤抗蝕性能最差，不同恢復階段石礫含量大小為：裸地>草地>灌木林>喬林[77-82]。

3.4 退化喀斯特森林恢復評價

恢復評價是恢復生態(tài)學中所要研究的重要內(nèi)容，是檢驗人工恢復實踐和自然恢復狀態(tài)的技術(shù)手段[83-84]。喻理飛等在分析群落組成、結(jié)構(gòu)、功能變化的基礎(chǔ)上，提出評價退化群落自然恢復的3個指標，即退化群落自然恢復的潛力度（restoration potentiality，RP）、恢復度（restored degree，RD）和恢復速度（restoration speed，RS）[40-41]。高華端等通過對喀斯特生態(tài)系統(tǒng)植被恢復的研究，認為對喀斯特森林的恢復評價主要有以下幾方面的指標：群落水平指標、綜合指標、生理指標、種群及個體水平指標、物化指標等[85]。

宋利榮等人選擇與喀斯特植被恢復緊密相關(guān)的群落高度、生物量、顯著度、物種多樣性指數(shù)、生態(tài)優(yōu)勢度、均勻度和蓋度，7個因子構(gòu)成評價指標，用層次分析法計算各指標的權(quán)重值，對植被自然恢復程度進行評價[86]。

3.5 退化喀斯特森林恢復技術(shù)

孫德亮等[87]認為喀斯特地區(qū)退化植被生態(tài)系統(tǒng)修復技術(shù)主要有：生物修復技術(shù)、植被自然恢復與重建技術(shù)、植被人工恢復與重建技術(shù)。等認為喀斯特地區(qū)石漠化治理的植被修復技術(shù)主要有：封山育林的植被恢復模式，喬灌混交防護林的植被恢復模式，生態(tài)經(jīng)濟林的植被恢復模式。喻理飛[51]等認為退化喀斯特森林的修復技術(shù)主要有：人工恢復技術(shù)和人工促進植被自然恢復的技術(shù)。梅再美等根據(jù)生態(tài)恢復的目標，認為喀斯特地區(qū)的植被恢復應采用人工促進植被白然恢復和人解除障礙因子，提高植被恢復和生態(tài)環(huán)境恢復的潛力、程度和速率。

4 研究展望

在退化喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)恢復方面，進行了對退化喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)退化原因、種組的耐旱適應性、恢復的過程及恢復過程中群落的動態(tài)研究，并提出退化喀斯特森林自然恢復途徑和評價，但缺乏對導致喀斯特生態(tài)系統(tǒng)退化過程的診斷的研究。且目前所有的這些研究都是建立在退化喀斯特生態(tài)系統(tǒng)的自然恢復基礎(chǔ)上，而對于喀斯特森林人工促進生態(tài)重建方面，缺乏對退化喀斯特森林恢復與重建的各種恢復途徑及技術(shù)措施的研究恢復技術(shù)與整治模式研究。

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第8篇：微生物多樣性分析方法范文

市政園林景觀是城市的重要基礎(chǔ)建設(shè)，其重要性主要表現(xiàn)在以下幾個方面：其一，促進城市文明建設(shè)，市政園林景觀綠化能夠促進環(huán)境和人類的可持續(xù)發(fā)展以及城市文明建設(shè)，這不僅體現(xiàn)在提高城市環(huán)境質(zhì)量，改善人們生活環(huán)境和提高人類身心健康方面，同時還體現(xiàn)了繼承與弘揚本國文化、提高人們文化修養(yǎng)、行為道德、藝術(shù)美德以及陶冶情操等方面；其二，提高生物多樣性，市政園林景觀綠化能夠人為的創(chuàng)造接近也自然生態(tài)環(huán)境的綠化場所，能夠為鳥類、動物、植物以及微生物等提供適合居住的環(huán)境，為實現(xiàn)城市生物多樣性奠定基礎(chǔ)；其三，綜合功能，園林植物綜合功能為城市生態(tài)環(huán)境提供的綜合功能是其他生態(tài)因子所不能提供的，例如能量流動產(chǎn)生的生態(tài)效益和生理活動的物質(zhì)循環(huán)；通過植物景觀創(chuàng)造的良好城市環(huán)境，為人們提供舒適休憩空間的社會效益；創(chuàng)造避災場、減災條件的城市安全效益；改善城市環(huán)境以及促進旅游發(fā)展的經(jīng)濟效益等；其四，環(huán)境資源保護作用，市政園林景觀綠化能夠通過模擬自然以及人工重建生態(tài)系統(tǒng)的方式，為城市創(chuàng)造接近自然的生態(tài)環(huán)境，對于城市原有生態(tài)環(huán)境的改造以及維護具有非常重要的作用，并且能夠塑造自然資源在城市人工環(huán)境中的積蓄、再生以及可持續(xù)利用。

2市政園林景觀綠化施工技術(shù)管理

（1）規(guī)劃設(shè)計技術(shù)管理

市政園林景觀綠化規(guī)劃設(shè)計技術(shù)管理主要包括以下幾個方面：其一，區(qū)域設(shè)計，二十一世紀市政園林景觀綠化必須突出區(qū)域特征，重點改善生態(tài)環(huán)境以及生物多樣性，實現(xiàn)城市區(qū)域社會、空間、環(huán)境、經(jīng)濟等的有機結(jié)合，保證景觀規(guī)劃設(shè)計符合可持續(xù)利用性、人居環(huán)境舒適性、野郊休閑性、生物多樣性、生態(tài)性等，創(chuàng)建城鄉(xiāng)一體化、城郊結(jié)合的生態(tài)綠地系統(tǒng)；其二，生態(tài)設(shè)計，市政園林景觀的生態(tài)設(shè)計應該以環(huán)境、生物、人等的良性關(guān)心的目標和前提，通過合理的生態(tài)設(shè)計實現(xiàn)城市健康、安全以及可持續(xù)的良性發(fā)展，調(diào)整信息流、能流以及物流的良性循環(huán)，促使城市生態(tài)要素和綠地的密切耦合，保證整個城市生態(tài)系統(tǒng)能夠更加高效、和諧的運行；其三，科學藝術(shù)設(shè)計，市政園林景觀設(shè)計會受到藝術(shù)的影響，生態(tài)環(huán)境態(tài)度變化、人類生活方式以及信息社會轉(zhuǎn)變，都會影響到市政園林景觀的設(shè)計，因此應該科學的發(fā)展以及改善設(shè)計以及技術(shù)方法，實現(xiàn)藝術(shù)性以及科學性的高度統(tǒng)一，適應人的心理和行為需求；其四，文化設(shè)計，通過市政園林景觀以及綠地植物的有機結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)城市總體形象的整合，創(chuàng)建形象鮮明、文化底蘊豐厚的特色城市園林景觀，對于促進整個城市的文化建設(shè)和發(fā)展具有非常重要的作用。

（2）施工現(xiàn)場清理和整理技術(shù)管理

當市政園林景觀規(guī)劃設(shè)計完成之后，應該對施工現(xiàn)場進行全面的清理，主要包括：生活垃圾、建筑垃圾、雜草、石塊等，防止造成物理性狀差、養(yǎng)分含量低、土壤偏堿性等，影響綠地植物的正常生長和發(fā)育。對于施工現(xiàn)場的平整，應該嚴格的按照設(shè)計標準以及園林景觀要求，將土方回填平整到設(shè)計標高，對施工現(xiàn)場進行翻挖，將表土破碎成符合設(shè)計要求的曲面或者平面，然后根據(jù)設(shè)計圖紙的相關(guān)要求進行整坡、整勢工作。

（3）植物配置技術(shù)管理

不同的綠色植物具有不同的特性，對于生長環(huán)境的要求也存在一定的差異，因此市政園林景觀在進行綠化時，應該根據(jù)當?shù)氐臈l件（光照強度、濕度、土壤理化形狀、氣候特征等）與植物特性（植株高度、綠色期、開花期、花色、適應性等），嚴格的遵循適地種植合適植物的原則。市政園林景觀綠化植物配置技術(shù)主要包括以下兩種方式：其一，改地適植物，包括整地、施肥、灌溉、混交以及土壤管理等技術(shù)；其二，改植物適地，包括育種、選種以及引種循環(huán)等技術(shù)。根據(jù)綠地的不同功能和性質(zhì)合理的選擇相應的植物并進行配置，保證高度搭配的合理性，例如，花壇的邊緣應該盡量選擇一些更低的蔓生或者低矮的種類，這樣能夠襯托出花壇中花的艷麗；種植面積相對較小時，應該盡可能的選擇低矮的種類；區(qū)域面積較大時，適當?shù)姆N植灌木或者喬木，由于這些樹種的上層開枝相對較小，可以在這些植被的下面種植一些高度適中的植物。此外，還應該重視色彩的搭配，植物的搭配應該重視色彩的對比以及變化，保證園林景觀色彩的多樣性。

（4）苗木選育技術(shù)管理

首先，應該創(chuàng)建苗木材料進場質(zhì)量抽檢和計劃跟蹤制度，認真的做好苗木材料的報驗以及自檢工作，對于苗木的品種、根系發(fā)育狀況、土球大小、冠幅、形狀、胸徑、高度等進行嚴格的把關(guān)，選擇根系發(fā)達、無機械損傷、無病蟲害、生長健壯的優(yōu)良苗木，保證進場的苗木都能夠滿足園林景觀綠化設(shè)計的相關(guān)要求，避免不合格的苗木進場，影響整個園林景觀工程的施工效果。

（5）苗木的種植技術(shù)管理

市政園林景觀綠化的苗木種植技術(shù)管理主要包括以下幾個方面：其一，草坪的播種施工以及草皮的鋪種施工，草坪應該選擇生長良好的草種，在大面積和坡地上，應該采用混播、噴播等相結(jié)合的方式進行施工；草皮應該選擇長勢良好、無雜草的草種，然后采用密鋪的方式進行施工，當鋪設(shè)完成之后還應該進行灌水和滾壓，以此保證綠地和草地的充分結(jié)合；其二，地被以及低矮灌木的種植技術(shù)管理，模紋花壇應該先種植圖案的輪廓線，然后再種植內(nèi)部的花種；宿根花卉以及一二年生花卉應該采用混合種植的方式，先種植宿根花卉再種植一二年生花卉；高矮不同的花苗在進行混種時，應該采用先矮后高的順序進行種植；坡勢花壇應該采用由上向下的方式進行種植；獨立花壇應該采用從中心向外的順序進行種植；大型花壇應該采用分塊、分區(qū)種植的方式；其三，大灌木、喬木的種植施工，大樹苗在運到施工現(xiàn)場之前，應該對樹形等進行嚴格的審視，調(diào)整好觀賞面的朝向，再配合吊車，將樹冠放正，對于裸根的樹苗，應該在種植穴中用土填成錐形，然后再進行回填，進行分層夯實。

（6）后期技術(shù)管理

其一，合理澆水，苗木種植后必須立即澆透定根水，通常采用小水慢澆的方式進行，2-3天之后澆第二次水，每次澆水應該澆透；其二，施肥管理，為了保證綠化苗木能夠達到設(shè)計要求，種植之前應該施足底肥，第一年不施肥，第二年根據(jù)具體狀況適當?shù)氖┘愚r(nóng)家肥；其三，搭棚遮陰，為了保證綠化苗木在種植之后迅速的恢復并良好的生長發(fā)育，應該搭建遮陰棚，避免水分蒸發(fā)過快，這樣既能夠保證綠化苗木的成活率，又能夠達到園林景觀綠化設(shè)計的相關(guān)要求。

3結(jié)語

第9篇：微生物多樣性分析方法范文

關(guān)鍵詞 脫氮硫桿菌；自養(yǎng)反硝化；水產(chǎn)養(yǎng)殖；分子生態(tài)學

中圖分類號 S949 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2012）14-0252-03水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國發(fā)展最為迅速的行業(yè)之一，對我國漁業(yè)經(jīng)濟的貢獻很大。隨著高密度、規(guī)模化的水產(chǎn)養(yǎng)殖的蓬勃發(fā)展，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境質(zhì)量日益下降，養(yǎng)殖環(huán)境污染不容忽視。一些傳統(tǒng)的通過投加化學物質(zhì)來控制養(yǎng)殖環(huán)境中的硫化物以及亞硝酸鹽含量的方法收效甚微，且可引來諸如蓄積殘留等更多的環(huán)境問題。近年來，人們開始嘗試在養(yǎng)殖水體中使用生物降解轉(zhuǎn)化方法來改善養(yǎng)殖水體的生態(tài)環(huán)境，以達到健康養(yǎng)殖的目標。因脫氮硫桿菌具有脫氮和脫硫的雙重特殊性質(zhì)，同時又是嚴格自養(yǎng)兼性厭氧型微生物，所以近年來受到了更多的關(guān)注。

1 養(yǎng)殖水體中的主要有害物質(zhì)及控制

1.1 亞硝酸鹽

氮在水體中以氮氣、游離氨、離子銨、亞硝酸鹽、硝酸鹽和有機氮的形式存在。總氮和總磷一直被認為是引起水體富營養(yǎng)化的重要因子，而氨氮和亞硝酸鹽氮是養(yǎng)殖過程中引起魚類疾病的關(guān)鍵環(huán)境因子，尤其是亞硝酸鹽濃度的超標（亞硝酸鹽向硝酸鹽轉(zhuǎn)化不完全），是近年來魚病發(fā)生的不可忽視的原因之一。養(yǎng)殖中發(fā)現(xiàn)，魚類易患“棕血病”，這是因為亞硝酸通過魚類鰓和體表進入到血液，與血紅蛋白結(jié)合生成高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力，血液成棕色。作為強氧化劑，亞硝酸鹽進入血液后擾亂氮排泄，降低氧合血紅蛋白水平使各組織缺氧，低濃度時可使抵抗力下降，易患各種疾病[1]；我國淡水漁業(yè)用水標準規(guī)定，養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽含量應控制在0.2 mg/L以下，集約化養(yǎng)殖技術(shù)能夠成功的關(guān)鍵就在于對水體中亞硝態(tài)氮的控制[2]。目前用生物降解轉(zhuǎn)化法降低養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽含量是頗為有效的方法。

1.2 硫化物

養(yǎng)殖水體中，大量殘餌、死藻、養(yǎng)殖生物排泄物等沉到水底增加了底部有機物含量，從而增加了硫化物的含量。硫化物作為重要污染物之一，同時也是監(jiān)測養(yǎng)殖水環(huán)境的重要化學指標，對魚蝦類的生長危害較為嚴重，毒性很大。水體中硫化物包括溶解性的H2S、HS-、S2-，以及存在于懸浮物中的可溶性硫化物和酸可溶性金屬硫化物[3]。硫化物可與養(yǎng)殖生物血液中的血紅蛋白結(jié)合產(chǎn)生硫血紅蛋白，降低了機體中血液的攜氧能力。同時，硫化物對養(yǎng)殖生物的鰓組織具有很強的刺激和腐蝕作用，可使組織產(chǎn)生凝血性壞死，引起生物呼吸困難，血液、腎中硫代硫酸鹽水平增加，大于2 mg/L可致養(yǎng)殖生物死亡。故我國漁業(yè)水質(zhì)標準中規(guī)定其在水質(zhì)中含量不得超過0.2 mg/L。管越強等[4]發(fā)現(xiàn)日本沼蝦中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力隨硫化物濃度的升高而增強，其免疫系統(tǒng)對硫化物有一定的耐受力，而當硫化物濃度過高時，沼蝦的免疫能力降低，對機體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生顯著的影響。余 靜等[5]以過氧化物酶（POD）和酚氧化酶（PPO）作為指標，研究了硫化氫脅迫對羅氏沼蝦的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)POD和PPO酶在低濃度硫化氫處理下的活性顯著提高，可能是對蝦體內(nèi)免疫系統(tǒng)應激反應的表現(xiàn)，當硫化氫濃度超過耐受范圍后，細胞就會造成嚴重損傷，POD和PPO酶活力降低，這與管越強試驗研究結(jié)果相似。

1.3 養(yǎng)殖水體中主要有害物質(zhì)的控制

目前控制養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮和硫化物的方法很多，水培植物（如浮床栽培空心菜[6]、鳳眼蓮、水花生、萵苣等）異養(yǎng)反硝化、自養(yǎng)反硝化、異養(yǎng)和自養(yǎng)相結(jié)合的方法等均有報導。不足的是水培植物的脫氮效率很低，譚洪新等[7]在研究水栽培蔬菜對養(yǎng)魚廢水的水質(zhì)凈化效果時發(fā)現(xiàn)，水培蔬菜對硝氮的去除率只有3.7%；吳 偉等[8]通過在池塘水體中栽種以輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）為主的水生植物，并添加活菌含量大于108 g/L微生物制劑，構(gòu)建了水生植物—微生物強化系統(tǒng)，研究該系統(tǒng)對日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）養(yǎng)殖水體的生物凈化效果。研究表明，當水體中添加的微生物質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，適宜的水生植物覆蓋率為40%，水生植物—微生物強化系統(tǒng)是一種良好的日本沼蝦養(yǎng)殖水體生物凈化系統(tǒng)。而水生植物與微生物相結(jié)合凈化水體，效果雖然較為顯著，但水生植物的栽培占面積較大，依然不是最理想的選擇。故利用高效的具有反硝化脫硫功能的微生物凈化養(yǎng)殖水質(zhì)、控制亞硝酸鹽和硫化物顯得尤其重要。

由于水產(chǎn)養(yǎng)殖需要保持充足的溶氧量，所以厭氧反硝化菌脫氮無法發(fā)揮正常的作用。具有一定溶氧量的養(yǎng)殖水體更有利于好養(yǎng)或兼性反硝化菌發(fā)揮作用。好養(yǎng)或兼性反硝化菌將硝酸鹽和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成氣態(tài)氮，且可將氨在好氧條件下直接轉(zhuǎn)化成氣態(tài)產(chǎn)物。

2 脫氮硫桿菌的性質(zhì)和作用原理

2.1 脫氮硫桿菌的生長特性

1904年，Beijerinck首先分離得到脫氮硫桿菌（Thioba-cillus denitrificans），其屬于硫桿菌屬；具有代表性的硫桿菌屬有排硫桿菌（Thiobacillus thioparus）、氧化硫桿菌（Thiobac-illus thiooxidans）、脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）和新型硫桿菌（Thiobacillus novellus）。脫氮硫桿菌廣泛存在于土壤、底泥、淡水和海洋沉積物、礦山排水、工廠、污水處理池和消化池；對溫度和pH值的變化敏感，最適生長條件pH值為6.5～8.0，最適溫度28～30 ℃。脫氮硫桿菌為革蘭氏陰性化能自養(yǎng)細菌，電鏡觀察，菌細胞短桿狀、單個、成對或短鏈狀排列，具有單根極生鞭毛，無芽孢，菌體大小約為0.3～0.8 μm×0.8～3.0 μm。能在好氧和厭氧條件下以硫代硫酸鹽和 S2-作為能源、以CO2作為碳源進行生長，厭氧條件下可以硝酸鹽作為電子受體還原為N2。該菌生長緩慢，無明顯的穩(wěn)定期且穩(wěn)定期持續(xù)時間較短，隨后進入衰亡期[9-10]。

2.2 脫氮硫桿菌反硝化原理

脫氮硫桿菌能在好氧和厭氧條件下以硫代硫酸鹽和S2-作為能源、以CO2作為碳源進行生長，厭氧（兼性厭氧）條件下可以硝酸鹽作為電子受體還原為N2。正因為脫氮硫桿菌以二氧化碳為碳源，對魚類有害的亞硝酸鹽、硫化氫等均可被氧化為無毒的物質(zhì)，同時減低了水體中的生物消耗量和化學耗氧量。其反硝化過程如下：脫氮硫桿菌胞內(nèi)含1，5-二磷酸核酮糖羧化酶和5-磷酸核酮糖激酶，可通過卡爾文循環(huán)途徑來固定CO2。脫氮硫桿菌以還原態(tài)硫作為電子供體，同時以硝酸鹽作為電子受體，將其還原為N2，完成自養(yǎng)反硝化過程[11]。厭氧條件下，脫氮硫桿菌氧化硫的反硝化過程具體如下：

1.1 S+0.4 CO2+NO3-+0.76 H2O+0.08 NH4+0.08 C5H7O2N+0.5 N2+1.1 SO42-+1.28 H+ （1）

0.844 S2O32-+NO3-+0.347 CO2+0.434 H2O+0.086 NH4++0.086 HCO3-0.086 C5H7O2N+0.5 N2+1.689 SO42-+0.697 H+（2）

0.421H2S+0.421HS-+0.346 CO2+0.086 NH4++0.086 HCO3-+NO3-0.086 C5H7O2N+0.5 N2+0.842 SO42-+0.434 H2O+0.262 H+ （3）

從NO3-還原到N2，經(jīng)一系列連續(xù)的4步反應完成：NO3-NO2-NON2ON2，分別由以下酶進行催化：硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶、一氧化二氮還原酶。通常細菌能否用于脫硫工藝的一個重要影響因素在于細菌產(chǎn)生的硫是積累在細胞內(nèi)還是在細胞外。如果積累在細胞內(nèi)，必然會產(chǎn)生大量的含硫細胞。這樣硫的分離就比較困難，為此必須選擇在細胞外形成硫的細菌，而脫氮硫桿菌即是具有這種特征的細菌。脫氮硫桿菌的優(yōu)點：一是嚴格自養(yǎng)，不需要投放有機物作為碳源，節(jié)省開支，同時也不會引入額外的有機物，避免水體的二次污染；二是產(chǎn)生極少量的污泥，能將污泥處理量降低到最小[12]；三是不僅能在厭氧條件下生長，還可以利用硫化物。

3 脫氮硫桿菌的應用研究

鑒于脫氮硫桿菌具有脫氮和脫硫的特殊性質(zhì)，近年來對脫氮硫桿菌的應用研究十分活躍。脫氮硫桿菌是典型的硫自養(yǎng)反硝化菌，有關(guān)研究主要集中在防腐應用、油田廢水處理領(lǐng)域。作為微生物腐蝕的主要菌種之一的硫酸鹽還原菌（SRB），脫氮硫桿菌能夠與SRB共存，以氮源反硝化作用，抑制腐蝕性產(chǎn)物硫化物的產(chǎn)生，同時也在一定程度上抑制了SRB的生長，起到一定的防腐作用。汪梅芳等[13]利用靜態(tài)掛片以及交流阻抗法（EIS）研究了脫氮硫桿菌對碳鋼微生物的腐蝕影響，研究發(fā)現(xiàn)T. denitrificans的胞外高聚物增加了生物膜的致密性，阻礙了電荷傳遞過程，也降低了SRB的腐蝕。秦 雙等[14]將脫氮硫桿菌經(jīng)培養(yǎng)活化后用于抑制老化油儲油罐污水及油田廢水中微生物腐蝕及脫除硫化物，發(fā)現(xiàn)加入TD生物制劑后，污水中FeS的去除率可達42.85%；污水中無機硫化物的總量去除率可達91.05%。脫氮硫桿菌的加入降低了污水中腐蝕性硫化物的含量，進而減緩油水界面層對基體材料的腐蝕破壞，同時降低界面附近SRB的生長及活性硫化物的產(chǎn)生，從而抑制了惡臭污染物硫化亞鐵對環(huán)境的危害。

近年來，利用脫氮硫桿菌來處理地下水和飲用水這一自養(yǎng)反硝化工藝也得到了廣泛應用。Koenig等[15]在1997年進行了用脫氮硫桿菌處理垃圾填埋場滲濾污水，在填充不同粒徑硫磺的固定床反應器系統(tǒng)來處理硝酸鹽濃度高達400 mg/L的污水，為以后高濃度硝酸鹽污水處理提供了可行的依據(jù)。張承中等[16]利用脫氮硫桿菌接種至生物滴濾塔用于凈化硫化氫氣體濃度高達2 000～3 000 mg/m3，對硫化氫的脫除率高達92%，為工業(yè)化應用中處理高濃度的硫化氫氣體提供了依據(jù)。

同時脫氮硫桿菌在礦體地下水以及礦體圍巖地下水中活動性強，而在一般巖石或松散沉積物的地下水中活動較弱。因此，脫氮硫桿菌可以作為指示性微生物，作為礦化的直接指標。

4 脫氮硫桿菌篩選馴化以及分子生態(tài)學水平上的研究

因脫氮硫桿菌生長緩慢，對溫度以及鹽度的耐受性不強等限制了其應用，對于養(yǎng)殖水體而言，從養(yǎng)殖水體污泥中有效的篩選、培養(yǎng)和馴化脫氮硫桿菌，因溫度、pH值等是脫氮硫桿菌生長的主要影響因素，因而可通過建立溫度、pH值梯度進行穩(wěn)定性馴化培養(yǎng)。采用添加特殊指示劑的培養(yǎng)基對脫氮硫桿菌也可以進行初步篩選，通過反硝化過程堿度變化，相應指示劑顏色變化，即可在篩選平板上出現(xiàn)特殊顏色的菌落。牛建敏等[17]從湖水、底泥、土壤、厭氧污泥等不同環(huán)境中采集菌種從培養(yǎng)、分離得到10種脫氮硫桿菌菌株，不同環(huán)境中脫氮硫桿菌在生理生化上存在差異，通過比較它們的硝酸鹽氮去除速率，以期獲得活性更強以及工程應用價值最大的菌株。同時，深入探討脫氮硫桿菌的基因組學、蛋白組學技術(shù)，利用基因重組、基因改組等分子生物學技術(shù)構(gòu)建高效基因工程菌，從而提高其生物脫氮的效率，是行之有效的方法。

養(yǎng)殖水體單靠脫氮硫桿菌單一菌株想達到高效率的脫氮除硫效果，還是有很大困難的，如若將脫氮硫桿菌與其他具有不同凈水功能的微生物菌株復合使用，根據(jù)治理對象的不同以及各種菌生理功能的差異，進行組合并采用多種工藝手段，以期達到治理大面積養(yǎng)殖水域的目的。目前，養(yǎng)殖水體中微生態(tài)制劑所涉及的微生物包括光合細菌、芽孢桿菌、硝化細菌、反硝化細菌等[18-20]。如養(yǎng)殖水體凈化有關(guān)研究[21]，從富營養(yǎng)化的養(yǎng)殖水體中分離篩選得到具有不同生理功能的污染物治理菌株，如硫化細菌、硝化細菌、反硝化細菌、光合細菌、生物絮凝菌等，經(jīng)優(yōu)化配伍成性能優(yōu)良的復合功能菌，因它們在生長過程中能產(chǎn)生的有用物質(zhì)及分泌物質(zhì)成為相互或各自的生長基質(zhì)，形成一種共生增殖關(guān)系，從而達到有效凈化養(yǎng)殖水體的目的。徐軍祥等[22]首先從高鹽高硫廢水中活性污泥中獲取脫氮硫桿菌，在不同濃度梯度下進行耐鹽能力穩(wěn)定性馴化培養(yǎng)，以獲得耐鹽脫氮硫桿菌，并與硝化菌混合培養(yǎng)形成復合菌劑，采用生物強化技術(shù)原理投加至廢水。結(jié)果發(fā)現(xiàn)投加復合菌能加快COD降解速度，增強耐負荷沖擊能力，提高COD、NH3-N和硫代硫酸鹽（THS）的去除率。所謂的生物強化技術(shù)（bioaugmentation）即是為了提高原系統(tǒng)的廢水處理能力，向原系統(tǒng)中投加從自然界中馴化篩選的優(yōu)勢菌種或通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生的復合菌，以去除某一種或多種有害物質(zhì)的方法。該技術(shù)自20 世紀80年代以來被廣泛研究。

近年來，固定化微生物脫氮技術(shù)在養(yǎng)殖水質(zhì)的控制上應用廣泛，其優(yōu)點包括在污廢水脫氮治理中能夠長期保持活性；可重復使用，節(jié)省投資；易于固液分離；有利于屏蔽或減少土著微生物、毒性物質(zhì)及外界環(huán)境變化的干擾，可使含氮污水達到更好的修復效果[23]。因此，嘗試將脫氮硫桿菌固定化投放到養(yǎng)殖廢水中以便高效利用也是未來研究工作中所要努力的方向。也有研究將脫氮硫桿菌與形成絮凝體的異養(yǎng)細菌一起培養(yǎng)使脫氮硫桿菌得到固定化，從而形成性能良好的絮凝物以除去H2S。

據(jù)統(tǒng)計，目前人們能夠培養(yǎng)的微生物不足環(huán)境微生物總量的3%。近些年來，分子微生態(tài)學和現(xiàn)代生物化學的迅速發(fā)展推動著養(yǎng)殖水體微生物學的發(fā)展，人們逐漸通過分子生態(tài)學技術(shù)深入研究環(huán)境微生物如RLP技術(shù)用于研究環(huán)境微生物多樣性；用DGGE 技術(shù)研究反硝化微生物基因多樣性，車 軒等[24]PCR-DGGE技術(shù)從總DNA中擴增出目標16 S rDN斷，再對擴增的16 S rDNA進行DGGE分析，對凝膠染色并進行條帶統(tǒng)計分析和切膠測序，使用序列數(shù)據(jù)進行同源性分析并建立了系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，RT-PCR及實時熒光定量PCR技術(shù)研究環(huán)境反硝化微生物種群的定量研究。因為硫桿菌屬種類較多，種間差異不大，因而用分子生物學手段對其進行分類鑒定，如運用16 S rDNA分析來鑒定脫氮硫桿菌，是更具優(yōu)勢的也是較普遍的一種方法。

脫氮硫桿菌作為氮素循環(huán)的重要微生物，其分子生態(tài)學上的研究不是很深入，因此提出了脫氮硫桿菌專一性PCR引物和探針，已經(jīng)成為微生物生態(tài)學的迫切要求。趙陽國等[25]研究設(shè)計了脫氮硫桿菌在種級水平的專一性PCR引物/探針。脫氮硫桿菌專一性引物/探針的提出，將為不同生態(tài)環(huán)境中該種微生物的時空分布、結(jié)構(gòu)動態(tài)以及實時定量等研究提供分子生物學工具。Robert S運用外源DNA探針從質(zhì)粒庫中分離出來2種轉(zhuǎn)錄脫氮硫桿菌1，5-二磷酸核酮糖的基因，并運用限制性酶分析2種基因的長度大小。此次研究也為脫氮硫桿菌在分子水平上的研究及應用奠定了一定的基礎(chǔ)。

5 脫氮硫桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用前景與展望

目前對自養(yǎng)反硝化菌脫氮硫桿菌的應用研究主要集中于飲用水、地下水、廢水處理、防腐應用，而對養(yǎng)殖水處理的研究報道則較少。因循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)具有節(jié)省空間、節(jié)約水資源、高產(chǎn)、高回報效益的優(yōu)點的，作為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)代化的支撐技術(shù)力量，該體系為工業(yè)化水產(chǎn)養(yǎng)殖提供了很好的技術(shù)模式。鑒于自養(yǎng)反硝化菌的諸多優(yōu)點，有研究試著將脫氮硫桿菌運用到循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。自養(yǎng)反硝化過程會消耗一定的堿度，并且RAS系統(tǒng)水是循環(huán)使用的，所以長期下去可能有硫酸根的積累，而隨著硫酸根濃度的升高反過來又會抑制脫氮速率。車 軒[26]綜述了在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（RAS）中運用脫氮硫桿菌除硝酸鹽的可行性，他提出將產(chǎn)生堿度的異養(yǎng)反硝化與自養(yǎng)反硝化進行集成，具有極大的潛力。將二者集成的脫氮方法具有兩大優(yōu)勢：一方面碳源的消耗遠遠低于完全異養(yǎng)反硝化脫氮；另一方面使硫酸鹽濃度得到有效控制。因此，在養(yǎng)殖水處理的實際應用中具有極強的可行性。有研究采用硫酸鹽還原菌、脫氮硫桿菌和異養(yǎng)反硝化菌在生物滴濾塔中的填料表面進行掛膜，進行同步脫除SO2和NO試驗，通過不同菌種的協(xié)同作用，SO2氣體平均去除率達到了97.6%，而NO氣體的平均去除率達到了51.4%。

而Sora運用MSC（modified spent caustic）即改良的廢堿液投加到以硫為電子供體自養(yǎng)反硝化過程中去以補充消耗的堿度，使反硝化進程能持續(xù)的進行；同時SC的應用證實了污水脫氮的高效性，即COD/N的比值較低。若COD和TN含量過高的話，還要考慮到SC的添加劑量問題。

6 小結(jié)

自養(yǎng)反硝化技術(shù)對養(yǎng)殖水體凈化的應用方面較小。有關(guān)耐鹽、耐高低溫的脫氮硫桿菌菌株的篩選馴化研究還需進一步加強，對脫氮硫桿菌尤其是分子水平的研究還不夠深入。目前，硫自養(yǎng)反硝化技術(shù)還處于實驗室研究及中試階段，如果考慮將脫氮硫桿菌等反硝化細菌應用于河流、湖泊、魚蝦等養(yǎng)殖水體或自然水體中，其在實際應用中的功能是否穩(wěn)定將有待探討，目前相關(guān)研究已經(jīng)證明脫氮硫桿菌對養(yǎng)殖水體生物無害，但是否影響水體中其他有益微生物的生態(tài)位，還有待探討未來致力于脫氮硫桿菌上的研究還很多，任務更繁重。

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