商業(yè)計(jì)劃書(shū)感想精選(九篇)

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第1篇：商業(yè)計(jì)劃書(shū)感想范文

關(guān)鍵詞:紅花注射液;內(nèi)毒素;急性肝損傷;Bax Bcl-2;Bax/Bcl-2

中圖分類號(hào):R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1673-7717(2010)01-0159-04

Effects of Safflower Injectionon on Bax Bcl-2 and Bax/Bcl-2 in Rats with

Acute Hepatic Injury

CHEN Ying1,HUANG Xiaomin2

(1.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053,Zhejiang,China;

2.Zhejiang Hospital of TCM,Hangzhou 310006,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:To observe the protective effects and mechanism of safflower injection (SI) on rats with acute hepatic injury (AHI) induced by endotoxin. Methods:80 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into ten groups, three SI treated groups, three reduced glutathione treated groups, three AHI model groups, and one control group. The rats were intraperitoneal-injected with Lipopolysaccharide (LPS) plus D-galactosamine (D-GalN) for modeling. The SI treated groups was injected SI into a tail vein, and the reduced glutathione treated groups was was injected reduced glutathione as the positive control. The blood from the abdominal vein and liver tissue samples were obtained at 6h, 24h and 48h after modles established. The contents of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were tested, the hepatic pathological changes were observed with hematoxylin-eosin (HE) stain, and the expression of Bax, Bcl-2 were detected by immunohistochemical studies. Results:Compared with the control group, serum levels of ALT and AST in rats of the model groups significantly elevats at 6h, 24h and 48h time points (P

Key words:SafflowerInjection; endotoxin; acute liver injury; Bax;Bcl-2; Bax/Bcl-2

紅花又名紅藍(lán)花、草紅花、刺紅花,藥用來(lái)源于雙子葉植物綱菊科一年生草本植物紅花CarthamustinctoriusL的筒狀花冠,始載于《開(kāi)寶本草》,性味辛、微苦、溫,歸心、肝經(jīng),具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效?！侗静菥V目》記載紅花能“活血潤(rùn)燥、止痛、散腫、通經(jīng)”,為內(nèi)、外、婦、傷各科血瘀證的要藥。紅花注射液是由中藥紅花中提取制備的滅菌水溶液,其主要成分是紅花黃色素(safflor yellow,SY)。研究證實(shí):活血化瘀注射液可顯著提高內(nèi)毒素血癥大鼠生存率, 拮抗炎性細(xì)胞因子, 減輕肝細(xì)胞損傷, 對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠有一定的保護(hù)作用[1]。本實(shí)驗(yàn)欲通過(guò)紅花注射液對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠模型[2]大鼠的Bax、Bcl-2表達(dá)及其比值的影響,并與傳統(tǒng)護(hù)肝藥還原型谷胱甘肽對(duì)照,探討預(yù)防性給予紅花注射液對(duì)內(nèi)毒素性急性肝損傷的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源 分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠80只,體重(200±10)g(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為模型組、紅花注射液干預(yù)組(紅花組)、還原型谷胱甘肽干預(yù)組(TAD組)及空白對(duì)照組。模型組時(shí)相點(diǎn)設(shè)為6、24、48h,紅花注射液干預(yù)組、還原型谷胱甘肽干預(yù)組(TAD組)時(shí)相點(diǎn)同模型組;每時(shí)相點(diǎn)10 只動(dòng)物;空白對(duì)照組10只動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

模型組以腹腔注射LPS(Sigma公司)(50μg/kg)+D-GalN(Sigma公司)(300mg/kg)建立大鼠急性肝損傷模型;紅花組、TAD組在建模前0.5h分別以紅花注射液(生產(chǎn),批號(hào)071101)(2.5mL/kg)、還原型谷胱甘肽(商品名:泰特、TAD,意大利福斯卡瑪生化制藥公司生產(chǎn),批號(hào)37016/37003)(108mg/kg)尾靜脈注射1次。

1.3 標(biāo)本采集與處理

紅花組、TAD組、模型組分別于建模后各時(shí)相點(diǎn)及空白對(duì)照組在6h時(shí)3%戊巴比妥鈉(1mL/100g)腹腔注射麻醉,在無(wú)菌條件下腹腔靜脈取血4mL,離心分離血清,ElectroluxBCD-277雙溫冰箱-20℃保存?zhèn)溆?。取肝左葉組織于10%中性甲醛溶液中固定,固定后的肝組織常規(guī)方法石蠟包埋、切片。

1.4 肝損傷指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 血清生化指標(biāo)測(cè)定使用日立7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠ALT、AST水平。

1.4.2 肝組織病理切片 組織切片常規(guī)HE染色,光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 肝組織細(xì)胞的Bax Bcl-2表達(dá)

參照二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(上?；蚣夹g(shù)有限公司,兔抗鼠bax多克隆抗體、兔抗鼠bcl-2多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)推薦方法進(jìn)行。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400倍),根據(jù)著色程度及著色細(xì)胞陽(yáng)性范圍進(jìn)行計(jì)算,著色程度:不著色者為0分,著色淡者為1分,中等著色為2分;著色深者為3分。著色細(xì)胞陽(yáng)性范圍;無(wú)著色為0分,著色陽(yáng)性細(xì)胞小于1/3為1分,著色陽(yáng)性細(xì)胞1/3～1/2為2分,著色陽(yáng)性細(xì)胞大于1/2為3分;將每張切片著色程度與著色細(xì)胞陽(yáng)性范圍得分各自相加為其最后計(jì)分。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析,資料以±s表示,計(jì)量資料組間差異采用單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料組間差異采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn),兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 光學(xué)顯微鏡下病理檢查

空白對(duì)照組大鼠肝組織光鏡下結(jié)構(gòu)完整、清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,無(wú)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)肝組織細(xì)胞變性壞死現(xiàn)象;模型組大鼠肝組織6h切片可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和點(diǎn)片狀壞死,24h切片肝組織結(jié)構(gòu)尚存,可見(jiàn)肝組織細(xì)胞腫脹、邊界模糊,肝組織細(xì)胞有大片狀壞死和多量炎細(xì)胞浸潤(rùn);48h切片肝組織小葉結(jié)構(gòu)紊亂,可見(jiàn)肝組織細(xì)胞壞死更加明顯,彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。紅花組及TAD組大鼠肝組織細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少,肝組織細(xì)胞水腫減輕,肝小葉結(jié)構(gòu)接近空白對(duì)照組肝組織,其病理改變較模型組同時(shí)間點(diǎn)明顯減輕。

2.2 血生化檢測(cè)

模型組血清ALT、AST在6h開(kāi)始增高,48h血清ALT、AST仍處于較高水平,各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定均顯著高于對(duì)照組;紅花組及TAD組大鼠血清ALT、AST各時(shí)間點(diǎn)雖高于對(duì)照組,但明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.3 肝組織Bax Bcl-2蛋白表達(dá) Bax Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿棕黃色染色。

Bcl-2在大鼠肝組織主要表達(dá)在匯管區(qū)、肝竇、肝組織細(xì)胞的胞漿中;Bax在主要表達(dá)在肝組織細(xì)胞漿,其次在肝竇和中央靜脈有表達(dá),見(jiàn)圖1、圖2?？瞻讓?duì)照組可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá);模型組各時(shí)間點(diǎn)Bax、Bcl-2蛋白明顯上調(diào),與空白對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

3 討 論

急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是指原來(lái)不存在肝硬化的病人在一種或多種較強(qiáng)的致病因素作用下,引起的急性、大量肝組織細(xì)胞壞死,或肝組織細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器嚴(yán)重功能障礙,在疾病發(fā)生26周內(nèi)出現(xiàn)肝功能迅速惡化,并導(dǎo)致精神異常及凝血障礙的一種臨床綜合征,具有相當(dāng)高的死亡率。ALF的發(fā)生是肝組織細(xì)胞的急性大量死亡不能為細(xì)胞增生所補(bǔ)償?shù)慕Y(jié)果[3]。研究證實(shí)急性肝衰竭患者肝組織細(xì)胞的死亡表現(xiàn)為凋亡和壞死, 而且凋亡是其主要的病理改變[4]。人體肝組織學(xué)檢查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了凋亡在急性肝損傷、肝衰竭的細(xì)胞死亡中起重要作用[5-6]?，F(xiàn)在認(rèn)為,肝組織細(xì)胞凋亡是肝衰竭分子機(jī)制中最重要的事件[7]。

早在1995年韓德五就提出內(nèi)毒素血癥特別是腸源性內(nèi)毒素血癥是肝功能衰竭發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。內(nèi)毒素引起的臟器功能損傷和多器官功能障礙綜合征過(guò)程中,肝臟既是清除內(nèi)毒素的主要器官,同時(shí)也是內(nèi)毒素血癥時(shí)受損最早、最明顯的靶器官之一[9]。本實(shí)驗(yàn)研究中,筆者采用LPS/D-GalN急性肝損傷大鼠模型。D-GalN為一種選擇性損害肝臟的藥物,能消耗肝細(xì)胞三磷酸尿酐(UTP),抑制RNA合成;促使肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺,造成結(jié)腸水腫,使腸源性內(nèi)毒素吸收增加,增強(qiáng)小鼠對(duì)LPS的敏感性(約100 000倍)[10];而LPS與血清中的LPS結(jié)合蛋白(LBP)形成復(fù)合物, 與細(xì)胞膜上的結(jié)合受體CD14結(jié)合后, 在MD2等蛋白協(xié)同作用下, 由信號(hào)受體TLR4將信號(hào)傳導(dǎo)到胞內(nèi), 促進(jìn)炎癥介質(zhì)IL-1、TL-6和TNF-α的釋放,導(dǎo)致肝組織細(xì)胞凋亡、壞死[11]。

ALT、AST為氨基酸代謝中的重要酶,在于肝組織細(xì)胞內(nèi)ALT主要分布于細(xì)胞漿內(nèi),AST分布于細(xì)胞漿和線粒體中,正常時(shí)血清內(nèi)含量很低,當(dāng)肝組織細(xì)胞受損傷時(shí),細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,即可從細(xì)胞內(nèi)逸出而進(jìn)入血液循環(huán)中,此時(shí)血清ALT、AST較正常增高,在排除肝外臟器病變的情況下,血清ALT、AST在一定程度上反映了肝組織細(xì)胞損害和壞死的程度。本實(shí)驗(yàn)中,模型組與空白對(duì)照組比較顯示:LPS在6h內(nèi)即造成了D-GalN致敏大鼠血清ALT、AST升高,且肝組織見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和點(diǎn)片狀壞死進(jìn)行性加重,表明LPS+D-GalN可成功復(fù)制急性肝損傷。紅花注射液及還原型谷胱甘肽預(yù)處理的兩組大鼠肝臟的細(xì)胞壞死和炎癥程度均較模型組明顯降低,血ALT、AST均明顯下降,表明紅花注射液對(duì)內(nèi)毒素性急性肝損傷大鼠具有較好的保護(hù)作用,并于24h、48h時(shí)作用較明顯,且效果與還原型谷胱甘肽相當(dāng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡是受Bcl-2蛋白家族、調(diào)節(jié)蛋白凋亡激酶激活因子1(Apaf-1)、caspase蛋白家族等調(diào)控的。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中兩個(gè)典型的抑凋亡和促凋亡蛋白,且二者通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Bax與Bc1-2形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)了Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的功能[12]。Bax與Bcl-2的比值決定同源二聚體(Bax/Bax)與異源二聚體(Bcl-2/Bax)的比值,這對(duì)決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)有重要意義。這一家族蛋白在腫瘤中研究最多,證實(shí)了在1993年Korsmeyer就提出的假說(shuō):在外界因素刺激下細(xì)胞的生死最終取決于Bcl-2和Bax兩種調(diào)控因子的平衡結(jié)果[13],但在內(nèi)毒素性急性肝損傷中研究較少。本實(shí)驗(yàn)中,免疫組化法檢測(cè)肝組織Bax、Bcl-2的表達(dá)結(jié)果顯示:模型組與空白對(duì)照組比較:在肝損傷程度加重的情況下Bax、Bcl-2表達(dá)均上調(diào)與以往研究中bax上調(diào), bcl-2下調(diào)[14],或bax上調(diào),bcl-2無(wú)顯著變化[15]并不完全一致,但是本實(shí)驗(yàn)中Bax/Bcl-2上升與以往研究結(jié)果一致,由此筆者認(rèn)為在內(nèi)毒素性急性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,Bax/Bcl-2比值可能與肝損傷程度正相關(guān),Bax/Bcl-2可能是肝組織細(xì)胞凋亡動(dòng)態(tài)變化的決定性因素之一。紅花組及TAD組與模型組比較:大鼠肝組織細(xì)胞Bax與Bcl-2表達(dá)及Bax/Bcl-2下降,表明紅花注射液對(duì)急性肝損傷大鼠的保護(hù)作用可能是通過(guò)下調(diào)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)及降低Bax/Bcl-2比值,從而抑制肝組織細(xì)胞的過(guò)度凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的,該途徑可能是其抗內(nèi)毒素性急性肝損傷的主要機(jī)制之一。

綜上所述,該實(shí)驗(yàn)于6h內(nèi)即成功復(fù)制了內(nèi)毒素性急性肝損傷大鼠模型。紅花注射液可明顯保護(hù)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝組織細(xì)胞損傷,此作用可能與Bax/Bcl-2比值降低,從而抑制肝組織細(xì)胞的過(guò)度凋亡有關(guān)。它為防治所致危重癥急性肝衰竭提供了新思路,并為臨床應(yīng)用紅花注射液防治急性肝損傷提供了部分理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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