微藻在功能性食品中的應(yīng)用

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二十碳五烯酸（EPA，20:5ω3），是ω-3系列的另一種重要的多不飽和脂肪酸，對心血管疾病的防治具有非常好的效果[6]，同時(shí)還具有抗炎活性[7]、免疫調(diào)節(jié)作用[8]、預(yù)防糖尿病腎臟疾病[9]和肌營養(yǎng)不良[10]等作用。二十二碳六烯酸（DHA，22:6ω3）也屬于ω-3型脂肪酸，它不僅作為一種重要的結(jié)構(gòu)脂類廣泛存在于大腦灰質(zhì)和視網(wǎng)膜中，而且還是心臟組織的關(guān)鍵組成部分。因此，DHA能促進(jìn)大腦和眼睛發(fā)育，對嬰兒和患心血管疾病的成年人具有重要作用[13]。DHA只少量存在于魚、肉和母乳中，牛奶不含有DHA。因此，健康營養(yǎng)組織建議將DHA添加到用于早產(chǎn)和足月嬰兒人工喂養(yǎng)的奶粉中，以促進(jìn)這類嬰兒的大腦發(fā)育和腦細(xì)胞的增生[1]。世界批發(fā)市場每年嬰幼兒配方奶粉的銷售額大約在100億美元[11]。2003年DHA的全球生產(chǎn)量達(dá)到了700噸[12]，全球有超過60個(gè)國家在配方奶粉中添加了DHA（如：英國、墨西哥、中國、美國、加拿大等）。在我國，2006年市售食品級(jí)低濃度(22%~25%)DHA價(jià)格在26.9萬元~36.5萬元/t；食品級(jí)高濃度DHA(27~30%)為73萬元~109.5萬元/t，而純度為99.9%的DHA售價(jià)高達(dá)16.8萬美元/kg。最近十年我國超長鏈多不飽和脂肪酸油脂的生產(chǎn)和消費(fèi)得到大幅度的增長，據(jù)分析2011年DHA在中國市場的銷售量達(dá)到4300t。

大多數(shù)高等植物和人類缺乏合成超長鏈多不飽和脂肪酸（VLCPUFAs）的必需酶[13]，人類必須從食物中獲得這些必需脂肪酸。實(shí)際上，魚和肉是人類獲得VLCPUFAs的主要來源，但利用魚油生產(chǎn)的VLCPUFAs具有腥臭味，容易氧化，大大的影響了產(chǎn)品的質(zhì)量。但是，微藻來源的DHA沒有這樣的風(fēng)味缺陷，如在月餅中添加微藻DHA油脂并不影響月餅的風(fēng)味[14]。此外，由于深海魚類資源有限和環(huán)境保護(hù)的需要，以魚油作為VLCPUFAs來源受到了很大的限制。幸運(yùn)的是，許多微藻可以生產(chǎn)ARA、EPA和DHA等多不飽和脂肪酸（如表1），因此，微藻具有取代魚油作為VLCPUFAs主要來源的潛力。然而，迄今為止只有DHA能夠利用微藻商業(yè)化地生產(chǎn)，其他的VLCPUFA都還不能利用微藻商業(yè)化生產(chǎn)。盡管EPA和ARA也存在于微藻中，如：紫球藻（Porphyridiumpurpureum）、三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）、等鞭金藻（Isochrysisgalbana）、微擬球藻（Nannochloropsissp.）和硅藻（Nitzschialaevis）都含有較高含量的EPA和ARA[22~23]，但是由于生產(chǎn)成本高昂，利用這些微藻進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)尚無經(jīng)濟(jì)競爭力。通過基因改造提高微藻產(chǎn)VLCFAs的能力可能是實(shí)現(xiàn)利用微藻商業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑[16,24]。微藻生長速度快，產(chǎn)油速率遠(yuǎn)高于動(dòng)物，更是高等植物產(chǎn)油率的百倍以上[3]。此外，許多藻類積累甘油三酯的含量達(dá)到了藻干重的50%以上[2~3]。因此，微藻是生物合成VLCFAs的理想工具。因此，可以通過生物技術(shù)手段，通過將合成VLCFAs途徑中的一些關(guān)鍵酶（如延長酶和脫氫酶）的基因轉(zhuǎn)入微藻，通過調(diào)節(jié)脂肪酸合成代謝途徑的代謝流，可以增加VLCFAs的產(chǎn)量。

多糖

微藻在生長過程中能合成大量多糖，作為微藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分和能量儲(chǔ)存物質(zhì)或在受到外界刺激時(shí)用于自我保護(hù)，其中許多多糖有益人體健康。一些微藻多糖具有抗病毒、抗菌活性。Santoyo等[25]人從小球藻（Chlorellavulgaris）中提取的多糖對非洲綠猴腎細(xì)胞單純皰疹病毒Ⅰ型具有抑制作用。Huleihel等[26]人從紅藻中分離獲得的硫酸多糖能夠滲透到細(xì)胞內(nèi)，作用于病毒，改變病毒復(fù)制周期，對單純皰疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型和水痘帶狀皰疹病毒等多種病毒的增殖具有抑制作用。Yim等人[27]報(bào)道了來自海洋微藻螺溝藻（Gyrodiniumimpudicum）的硫酸多糖對腦心肌炎病毒（EMCV）具有較強(qiáng)的抑制作用。Loke等人[28]從螺旋藻（Spirulina）中提取的螺旋藻多糖能減少幽門螺桿菌胃粘液的粘性，有利于預(yù)防幽門螺桿菌感染。微藻多糖也具有免疫調(diào)節(jié)作用。Suarez等[29]從蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa）中獲得一種阿拉伯糖與半乳糖構(gòu)成的多糖，它由“→2)-α-L-Araf-(1→3)-[α-L-Araf-(1→4)]-β-d-Galp-(1→”重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成，具有免疫刺激的功能，在胞外能較好的抑制皰疹病毒的活性。Yim[27]和Joung[30]等從赤潮微藻螺溝藻中提取的硫酸胞外多糖對機(jī)體具有免疫調(diào)節(jié)功能，它是一種含2.96%的糖醛酸和10.32%的硫酸基團(tuán)的半乳糖。而且，微藻硫酸多糖還能增強(qiáng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性，在溶血空斑試驗(yàn)中，加入此種多糖，可以增加IgM、IgG、IL-1β、IL-6、TNF-α等抗體含量，加快綿羊紅細(xì)胞的溶解。除此之外，也有研究證明微藻多糖具有抗氧化活性[31]。微藻多糖不僅在醫(yī)藥領(lǐng)域具有多種藥用價(jià)值，它還可以應(yīng)用于不同功能性食品開發(fā)。一些微藻多糖高度分支，甚至隔6~7個(gè)糖單體就分支[32]，使得多糖水溶液通常具有較高粘彈特性。微藻多糖的分子量在1~1000kDa[33]，通常具有凝膠特性。在微藻培養(yǎng)期間，一些胞外多糖分泌到培養(yǎng)液中導(dǎo)致培養(yǎng)液粘度增加，給微藻培養(yǎng)帶來困難，如在培養(yǎng)微藻生產(chǎn)油脂的工藝中[33]。但是可以利用藻多糖溶液這種非牛頓流體的特性，將多糖添加到食品中以獲得較好的食品流變特性[34]。微藻產(chǎn)多糖能力與微藻藻種和培養(yǎng)條件有很大關(guān)系，在某些條件下可以獲得很高的產(chǎn)量，布朗葡萄球藻（Botryococcusbraunii）在受到壓力刺激條件下，可以產(chǎn)生4~4.5g/L胞外多糖[35]。

色素

1類胡蘿卜素

類胡蘿卜素有400多種，其中β-胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素、玉米黃質(zhì)、番茄紅素和胭脂樹橙等都已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)。類胡蘿卜素最主要的用途是作為天然食用色素和功能性食品的配料。類胡蘿卜素具有由黃到紅的顏色，其中大部分呈橙色。近年來，由于某些化學(xué)合成色素存在毒性問題，應(yīng)用受到了限制，使得安全性高的天然色素獲得了廣闊的市場前景。此外，某些類胡蘿卜素本身就具有營養(yǎng)價(jià)值，Nesaretnam等[36]研究得出類胡蘿卜素在體內(nèi)能轉(zhuǎn)化成維生素A，同時(shí)，也有研究得出一些類胡蘿卜素具有抗氧化、抗癌和增強(qiáng)人體免疫功能的作用。類胡蘿卜素中β-胡蘿卜素已成功應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)。代謝生成β-胡蘿卜素的微藻較多，其中杜氏鹽藻（Dunaliellasalina）最適合大規(guī)模生產(chǎn)。有研究表明，在最佳培養(yǎng)條件下，其藻細(xì)胞生物量達(dá)290mg/L[37]，所產(chǎn)β-胡蘿卜素達(dá)到藻干重的14%[38]。杜氏鹽藻可以在開放池或生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)，澳大利亞、以色列、美國和中國都是杜氏藻的主要生產(chǎn)地。蝦青素（Astaxanthin）是一種酮類胡蘿卜素，同樣具有很高的商業(yè)價(jià)值。蝦青素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。有研究表明，蝦青素的抗氧化活性是葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素的10倍，α-生育酚的100倍[39]。同時(shí)，蝦青素已被證明具有其他生物活性，包括抗炎作用、保肝作用、保護(hù)心血管和腸胃、抗癌及治療神經(jīng)損傷等功效[40]。盡管，蝦青素具有明顯的生理活性，它主要還是應(yīng)用于飼料和食品行業(yè)。在飼料領(lǐng)域，蝦青素主要用作鮭魚飼料，其他魚蝦飼料也消耗了大量的蝦青素。全球水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料用蝦青素平均價(jià)格在2500美元/kg，銷售總額達(dá)到2億美元[41]。然而，目前供應(yīng)的蝦青素主要通過人工合成來獲得[1]，由于擔(dān)心合成色素的安全性，市場上對天然蝦青素的需求快速增長。植物、酵母菌、真菌和藻類都可合成蝦青素，但是只有少數(shù)微生物（含微藻）的蝦青素含量相對較高，如：雨生紅球藻（Haematococcuspluvialis）、小球藻（Chlorellasp.）、綠球藻（Chlorococcumsp.）以及紅發(fā)夫酵母（Huffierrhodozymaji）和橙黃農(nóng)桿菌（Agrobacteriumaurantiacum）[42]，其中，雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素能力較強(qiáng)，其體內(nèi)的蝦青素積累量能夠達(dá)到干基的4~5%[43]。

2藻膽蛋白

藻膽蛋白是一類由藻膽色素與相應(yīng)的脫輔基蛋白中保守性半胱氨酸殘基的巰基以硫醚鍵共價(jià)結(jié)合而成的色素蛋白（又名藻紅素或藻藍(lán)蛋白）。在原核藍(lán)藻和真核紅藻中，不同的藻膽蛋白通過連接多肽組成高度有序的超分子復(fù)合物—藻膽體，由“錨蛋白”將其“錨”在類囊體膜上，作為光合作用的捕光色素系統(tǒng)。根據(jù)生物體和培養(yǎng)條件的不同，藻膽體由10~20個(gè)不同的蛋白質(zhì)組成，而其中又以藻膽蛋白的含量為最高，可達(dá)細(xì)胞干重的40%。藻膽蛋白容易分離，易于成為具有商業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的天然色素[44]。大量研究表明，藻膽蛋白具有促進(jìn)健康的功能[7]。其光化學(xué)特征主要表現(xiàn)為摩爾吸收系數(shù)高、熒光量子產(chǎn)量高、斯托克位移大、低聚物穩(wěn)定性高、高光強(qiáng)等。這些特性使它們具有高能量和熒光敏感性，從而可用作生物檢測或診斷試劑[45]。用作商業(yè)生產(chǎn)的藻膽蛋白大多來自藍(lán)藻（如Arthrospira）和紅藻（如Porphyridium）[46]，其主要用途是作為食用色素以替代人工合成色素。由日本DIC集團(tuán)生產(chǎn)的一種稱作Linablue的微藻藻膽蛋白已成功用作食品添加劑，添加到口香糖、冰淇淋、冰棒、糖果、飲料和乳制品等食品中[47]。據(jù)估計(jì)，用藻膽蛋白制成的天然色素價(jià)格在3~25美元/mg，全球市場銷售額至少5000萬美元[1]。

3葉綠素

葉綠素及其衍生物是最好的天然綠色食品色素，被廣泛應(yīng)用于食用油、口香糖、冰淇淋、飲料、速食湯、奶酪和酸奶等食品中。對于食用色素級(jí)純度的葉綠素在使用劑量上沒有限制，因?yàn)樗鼈兓静槐幌牢?。目前，市場上使用的大多?shù)葉綠素色素都是從陸生植物提取而來，包括苜蓿草、蕁麻或一些牧草。在中國和日本，很大一部分葉綠素來自于蠶沙。雖然提取葉綠素的原材料比較便宜，容易獲得，提取工藝簡單，但是葉綠素提取率并不高。此外，在溫帶地區(qū)，原材料供應(yīng)有限，往往一年只有幾個(gè)星期能獲得原材料[48]。植物光合作用是將太陽能轉(zhuǎn)換為化學(xué)能的過程，在光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換過程中，葉綠素起著接收光能的作用。近年來，利用微藻生產(chǎn)生物燃料已成為一個(gè)熱點(diǎn)話題。其中微藻油脂用來生產(chǎn)生物柴油，而其他的生物質(zhì)可以通過熱解手段，液化或氣化成生物燃料。葉綠素含氮量較高，若葉綠素保留在微藻中進(jìn)入加工過程，則所得的生物燃料含氮量相對較高，在生物燃料燃燒過程中氮氧化物的排放量也會(huì)較高；同時(shí)，葉綠素本身是價(jià)值很高的色素，如果預(yù)先提取葉綠素并加以綜合利用，則葉綠素的收益可以抵消一部分生物燃料的生產(chǎn)成本。因此，在微藻生產(chǎn)中可將葉綠素作為主要目的產(chǎn)物之一，而將剩余的微藻材料用作生物燃料或飼料原料。Bai等人[49]在生物反應(yīng)器中對五種微藻產(chǎn)色素（主要是葉綠素和類胡蘿卜素）和油脂能力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，Dunaliellaprimolecta和Isochrysisaff.galbana產(chǎn)葉綠素能力最強(qiáng)，產(chǎn)量分別為5.3%和5.6%，其油脂產(chǎn)量分別為23%和24%。同時(shí)，Bai使用甲醇和正己烷提取微藻油脂和色素，使色素和油脂提取率分別達(dá)到了98%和90%。超臨界CO2萃取具有萃取快速、純化簡單、對環(huán)境的影響小的特點(diǎn)。大多數(shù)天然食品色素是熱不穩(wěn)定的，尤其是葉綠素，然而采用超臨界CO2萃取工藝色素在提取過程中不需經(jīng)歷加熱過程，有利于得到高質(zhì)量的色素，因此超臨界CO2提取技術(shù)是有機(jī)溶劑萃取很好的替代。有人采用超臨界CO2萃取微藻葉綠素，最終獲得了高的提取率和品質(zhì)好的葉綠素[50]。

肽

存在于微藻中或由微藻蛋白水解所得的肽具有較高的生物活性。在微藻加工業(yè)中，微藻蛋白通常被丟棄或用作動(dòng)物飼料。其實(shí)，我們可以從這些廢棄的蛋白中獲得一些高價(jià)值的肽，從而變廢為寶。此外，微藻在生長過程中本身就具有合成功能性肽的能力，這些肽存在于細(xì)胞中或被分泌到細(xì)胞外，因此也可直接從微藻細(xì)胞中提取生物活性肽。Sheih等[51]用胃蛋白酶水解廢棄的小球藻蛋白，最終獲得一種十一肽。這種多肽能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（AEC）活性，其半抑制濃度為29.6μmol。通過測序得出其氨基酸序列為Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe。這種十一肽不僅能抑制AEC活性，還具有較好的熱穩(wěn)定性（40~100℃）和酸堿穩(wěn)定性（pH=2~10）。除此之外，也有其他研究獲得具有AEC抑制活性的微藻蛋白水解肽。如，肽Ile-Val-Val-Glu（半抑制濃度為315.3μM）、Ala-Phe-Leu（63.8μM）、Phe-Ala-Leu(26.3μM)、Ala-Glu-Leu(57.1μM)和Val-Val-Pro-Pro-Ala(79.5μM)由水解小球藻蛋白所得。Suetsuna和Chen[52]水解鈍頂螺旋藻（Spirulinaplatensis）蛋白，獲得的肽Ile-Ala-Glu(34.7μM)，Phe-Ala-Leu、Ala-Glu-Leu、Ile-Ala-Pro-Gly（11.4μM）和Val-Ala-Phe(35.8μM)都具有較好的生物活性。通過水解微藻蛋白所得的一些肽還具有抗氧化活性。有研究者從小球藻蛋白水解產(chǎn)物中獲得了一種序列為VECYGPNRPQF的肽，具有抗氧化活性，能清除各種自由基，包括羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化基、DPPH自由基和ABTS自由基，并且其抗氧化活性比BHT、維生素E更有效。此外，這種肽不會(huì)被胃腸道酶水解，用人肺成纖維細(xì)胞系（WI-38）實(shí)驗(yàn)沒有細(xì)胞毒性[53]。微藻能合成一些結(jié)構(gòu)特殊的肽，環(huán)狀肽就是一個(gè)例子。從巨大鞘絲藻（Lyngbyamajuscula）分離獲得的環(huán)狀縮酚肽能有效抑制植物病原真菌的生長[54]。同時(shí)，Helms發(fā)現(xiàn)偽枝藻（Scytonemasp.）也能合成環(huán)狀肽，這種肽鈣通道阻滯作用[55]。

結(jié)論

微藻產(chǎn)生的功能性脂肪酸、色素、蛋白質(zhì)、肽和多糖等代謝物，具有較好的生物活性，可應(yīng)用于醫(yī)藥、能源領(lǐng)域，更可作為食品添加劑，特別是應(yīng)用于功能性食品開發(fā)。幾千年前，就有將微藻作為食物使用的記載，但人類對微藻的大規(guī)模培養(yǎng)卻只有幾十年的歷史。近年來，隨著微藻培養(yǎng)和加工技術(shù)的改進(jìn)，對微藻生物活性物質(zhì)物理、化學(xué)和生物特性了解的加深，為微藻生物活性物質(zhì)應(yīng)用于功能性食品添加劑提供了機(jī)會(huì)，同時(shí)，隨著人類研究的深入，有望將這些活性物質(zhì)應(yīng)用于新領(lǐng)域。（本文作者：王冬琴、譚瑜、盧虹玉、蘇偉明、胡雪瓊、李雁群 單位：廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院）