果蠅培養(yǎng)實驗注意事項分析

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【摘要】果蠅作為一種重要的模式生物，分布廣、易獲得、生活史短、遺傳變異易于檢測，適于實驗室研究。本文在簡要分析果蠅實驗室培養(yǎng)傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，從瓶塞制作、問題處理和管理方法等方面對果蠅培養(yǎng)實驗中的注意事項進行了探析。

【關(guān)鍵詞】果蠅；培養(yǎng)；實驗

果蠅原產(chǎn)于美洲,是完全變態(tài)發(fā)育的昆蟲。果蠅的發(fā)育要經(jīng)過卵、幼蟲、蛹、成蟲等幾個時期，從卵到成蟲只要10d左右，一年可以繁殖30代，在實驗室中卻常常出現(xiàn)生長遲緩甚至停滯、繁殖緩慢等問題，對實驗進程帶來不利影響。為保證實驗如期取得成果，果蠅在實驗室中的保種和繁育技術(shù)顯得十分重要。

1果蠅的基礎(chǔ)培養(yǎng)

1.1培養(yǎng)基的配置

果蠅的培養(yǎng)基有很多種。經(jīng)典常用的果蠅培養(yǎng)基的配方為：瓊脂4.5g、玉米粉24g、酵母粉48g、葡萄糖66g、1g/ml尼泊金甲酯9ml、補水60ml。高境鴻等的研究發(fā)現(xiàn)使用活酵母培養(yǎng)基可以大大提高果蠅的平均壽命，縮短果蠅發(fā)育周期[1]。但在使用過程中，活酵母培養(yǎng)基容易腐爛變質(zhì)，散發(fā)異味，或培養(yǎng)基底部出現(xiàn)氣體將整個培養(yǎng)基床抬高，對果蠅發(fā)育空間造成影響。實驗室應(yīng)根據(jù)對果蠅研究的具體需要來選擇合適的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制時要不斷攪拌，使培養(yǎng)基成分均勻，同時避免因局部溫度過高而燒焦培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基煮至微沸后冷卻20min，分裝至高溫滅菌后的果蠅瓶(高10cm、瓶底直徑6cm、瓶口直徑4cm的圓錐體)或者果蠅管(高9.5cm、直徑2.5cm的圓柱體)中[2]，如果使用培養(yǎng)管，每管內(nèi)培養(yǎng)基高度不超過2cm，等待培養(yǎng)基冷卻凝固，且果蠅管內(nèi)壁無可見水滴時，用高溫滅菌的瓶塞塞住瓶口。將需要培養(yǎng)的果蠅導入管內(nèi)，或者于4℃冰箱中保存。4℃保存時間不能過長(不超過一個月)，防止培養(yǎng)基腐爛或被污染。

1.2傳統(tǒng)的果蠅培養(yǎng)方法

果蠅的正?？缮鏈囟仍?2℃～32℃。25℃是果蠅生長發(fā)育和繁殖最適的溫度。在此溫度下，果蠅的生長發(fā)育速度較快，適合進行果蠅的雜交和擴繁等操作。在18℃時果蠅的生長發(fā)育和繁殖速度會明顯減慢,此溫度條件下需要進行果蠅的保種。過高或過低都會造成果蠅的死亡，實驗室中應(yīng)該使用設(shè)備控制合適的溫度，確保果蠅按需要生長。每天光照9h為宜，根據(jù)培養(yǎng)溫度不同，每間隔2-3周更換一次培養(yǎng)基，在需要大量實驗材料的情況下可以選擇擴大培養(yǎng)瓶體積、數(shù)量，或間隔更短時間更換培養(yǎng)基，以滿足實驗需要。更換培養(yǎng)基、繁育果蠅時，把羽化的果蠅20個左右,雌雄數(shù)目大致相等的成蟲移入新的培養(yǎng)基里。

2果蠅培養(yǎng)中應(yīng)注意的問題

2.1無菌處理

使用高壓蒸汽滅菌鍋（121℃20min）將實驗所用培養(yǎng)瓶、瓶塞、微量移液器槍頭滅菌，操作前將試驗臺使用75%酒精殺菌消毒，挑蠅板應(yīng)在更換不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的果蠅前用75%酒精消毒。2.2合適的濕度相對濕度是果蠅生存實驗中的重要因素，相對濕度過高或過低,都會對果蠅的生長發(fā)育造成影響。最適宜果蠅生長的相對濕度為50%左右。培養(yǎng)環(huán)境的濕度過高會使培養(yǎng)基發(fā)霉，導致培養(yǎng)基變黑、污染、無法使用。培養(yǎng)環(huán)境的濕度過低會使培養(yǎng)基變干，使果蠅不能產(chǎn)卵,也無法獲取需要的營養(yǎng)。

2.3恰當?shù)钠咳?/p>

培養(yǎng)管所使用的瓶塞應(yīng)具有良好的透氣性。如透氣性不佳，培養(yǎng)一段時間后會出現(xiàn)瓶內(nèi)相對濕度過高、發(fā)霉、氧氣不足等不適于果蠅生長發(fā)育的環(huán)境。帶小透氣孔的橡膠塞透氣性差，容易造成上述這種不利情況。主要原因在于，這種瓶塞的透氣孔容易被污染物堵塞，且因其透氣孔很小，清理極其困難，使用一段時間后將出現(xiàn)嚴重的透氣不良的狀況。比較合適的瓶塞是用棉花制作內(nèi)芯（要求棉量適中，不可過硬，難以塞入住瓶口或不透氣。也不可過軟,否則容易產(chǎn)生縫隙使瓶內(nèi)果蠅飛出），外面用紗布包裹纏繞，細線扎口，制成稍大于培養(yǎng)管瓶口大小的瓶塞。這種瓶塞使用壽命長、長時間使用也不易損壞、透氣性好、牢固又不與玻璃瓶口粘連，且價格低廉。不足之處是制作相對麻煩。現(xiàn)在實驗室中常用的海綿塞經(jīng)過多次高溫滅菌后容易變硬變小、長時間使用后質(zhì)地變脆、貼合在培養(yǎng)瓶玻璃上難以除去、使用壽命過短且價格偏高，性價比過低等缺點，同時具有市場供應(yīng)充足，且使用方便，透氣性、手感良好等優(yōu)點。如實驗室有足夠的經(jīng)濟條件，使用這種瓶塞更加節(jié)省時間。除了以上介紹的這兩種瓶塞之外，還有發(fā)泡棉制成的瓶塞，這種瓶塞成本較低，但孔洞較大，非常容易變形，且容易與瓶身綁材粘連，脫去綁材時非常容易從瓶口脫出，造成培養(yǎng)瓶內(nèi)果蠅逃逸。

2.4良好的麻醉效果

在果蠅的麻醉過程中，最忌諱麻醉致死。致死情況包括以下幾種：1）麻醉劑過量致死。2）因為操作不當，果蠅粘在培養(yǎng)基上，復蘇后因無法擺脫培養(yǎng)基的粘附致死。3）麻醉過程中果蠅飛出，為避免污染試驗環(huán)境而被人為處理致死。對于以上三種情況，在無特殊要求的前提下可以使用CO2（氣體）麻醉法麻醉果蠅，具體操作方法如下：先將果蠅培養(yǎng)瓶橫放，用充滿二氧化碳氣體的注射針管的針頭插入瓶塞與培養(yǎng)瓶間的縫隙，緩慢推動活塞，將氣體注入培養(yǎng)瓶，直至瓶內(nèi)果蠅全部被麻醉。該方法可以有效避免使用傳統(tǒng)乙醚麻醉產(chǎn)生的操作失誤致死和乙醚引起人體產(chǎn)生的不適；也可以最大程度的防止果蠅飛出，保證實驗材料的質(zhì)量、安全和潔凈。為了使用方便，也可以將針管替換為二氧化碳罐，連接軟管和槍頭，在使用時減少瓶塞與培養(yǎng)管壁之間的縫隙避免未被完全麻醉的果蠅從縫隙中飛出。在使用槍頭時也要注意控制氣流速度，防止果蠅在麻醉過程中被氣流沖出，造成材料損失。

2.5即時處理培養(yǎng)基問題

培養(yǎng)基是果蠅在實驗室中生長發(fā)育的基礎(chǔ)。當出現(xiàn)以下情況時，無論培養(yǎng)時間多久，都應(yīng)當立即更換培養(yǎng)基：1）培養(yǎng)基變色。果蠅培養(yǎng)期間可能出現(xiàn)培養(yǎng)基失去本來的顏色而變?yōu)榧t色、黑色等等，這種情況下應(yīng)當更換培養(yǎng)基。2）培養(yǎng)基上長出霉菌，或瓶塞上長出霉菌。此時不僅應(yīng)當更換培養(yǎng)基，也應(yīng)當清洗瓶塞。霉菌孢子漂浮于培養(yǎng)瓶的整個空間,包括果蠅身上,如將此果蠅接種到新的培養(yǎng)基中,在4-5d后，新接種的培養(yǎng)基同樣會長出霉菌。遇到該問題,不能再接種在發(fā)霉培養(yǎng)基中生長的果蠅,重新接種未長霉的果蠅。此外，還可以用周伯春的方法[3]，采取措施殺死果蠅身上的霉菌孢子，將帶有霉菌孢子的成蠅倒入空培養(yǎng)瓶中。具體操作步驟為：棉塞上倒適量的75%酒精,再將瓶口塞緊,利用酒精具有揮發(fā)性,揮發(fā)后的酒精充滿整個瓶內(nèi),從而將果蠅身上的霉孢子殺死。要注意：一是倒在棉塞上的酒精量要適量,過多果蠅易醉昏,過少殺不死霉菌孢子;二是果蠅呆在空瓶內(nèi)的時間要恰當,以2d為好。3）培養(yǎng)基過干或過濕。出現(xiàn)這種情況，培養(yǎng)基充足的情況下可以更換培養(yǎng)基，也可以用王轉(zhuǎn)斌的方法[4]來處理。4）培養(yǎng)基內(nèi)的果蠅幼蟲蟲體變細小，變透明。這種情況應(yīng)當考慮是病毒感染或者培養(yǎng)基成分問題，應(yīng)當收集已經(jīng)羽化的成蟲并更換培養(yǎng)基批次。

2.6得當?shù)墓芾矸椒?/p>

果蠅房機械化程度低，人工管理成本較高。果蠅的培養(yǎng)在一定溫度下具有很強的周期性，使用日期歸類可以更高效的管理實驗室和培育實驗材料。不同日期的培養(yǎng)批次按照更換培養(yǎng)基或接種的培養(yǎng)日期分類放置。在進行更換培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)基的操作時，可以根據(jù)日期分類管理培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)實驗材料時同樣根據(jù)日期批次來收取成蠅，這種方法可以控制收取到的成蠅所處的生理周期為實驗最適，也同時管理了不同生理周期的果蠅批次。按照日期批次記錄和管理，可以大大提高實驗室管理效率，減少工作量。

3結(jié)語

為保證實驗室果蠅正常培養(yǎng)繁育，需要正確的培養(yǎng)基配比、控制溫度、控制光照。特別要注意實驗前各種器具的無菌化處理，保持合適的濕度，選用恰當?shù)钠咳?，達到良好的麻醉效果，即時處理培養(yǎng)基問題，采取得當?shù)墓芾矸椒?，從而高效?yōu)質(zhì)的得到實驗結(jié)果。

參考文獻

[1]高境鴻,崔超杰,李俊玲.不同培養(yǎng)基配方對果蠅生長的影響[J].生物技術(shù)世界,2015(11):280.

[2]王霞,喬歡歡,潘麗霞等.果蠅新品系開發(fā)與種質(zhì)資源保存[J].實驗動物科學,2016(3):412.

[3]周伯春,汪珍春.培養(yǎng)果蠅三齡幼蟲的小技巧[J].生物學通報,2012,47(3):61.

[4]王轉(zhuǎn)斌.果蠅的保種技巧及唾液腺染色體的制備[J].實驗技術(shù)與管理,2002(3):37-39.

作者：尹佳寧 單位：濟南大學生物科學與技術(shù)學院