拉曼光譜在檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用分析

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拉曼光譜（Ramanspectra）屬于散射光譜范疇，是光與物質(zhì)相互作用而產(chǎn)生的［1］。在20世紀(jì)20年代由印度科學(xué)家C．V．拉曼首次發(fā)現(xiàn)并命名。單色光入射到某一介質(zhì)后產(chǎn)生的散射光大部分只發(fā)生方向的改變，其頻率與入射光保持一致，稱為瑞利散射；另有極少數(shù)散射光，其傳播方向及光波頻率均發(fā)生改變，這樣的散射就稱為拉曼散射［2］。拉曼首次提出分子可以改變?nèi)肷涔忸l率的理論，且改變量與散射層面分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)散射層面的分子結(jié)構(gòu)、分子基團(tuán)以及電子化環(huán)境均會對散射光頻率產(chǎn)生影響，而這些影響是根據(jù)材料特定的，從而可以通過散射光特點(diǎn)對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析［3］。由于拉曼光譜技術(shù)及由拉曼光譜術(shù)衍生出的亞技術(shù)在物質(zhì)檢測方面具有高效、簡便、無破壞性、成本低、非接觸性、樣本量少、樣本無需特殊制備、可重復(fù)性高、穩(wěn)定且不會對被試樣本造成物理和化學(xué)分解破壞等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于化工、刑偵、生物制藥、醫(yī)學(xué)檢驗等領(lǐng)域，并取得了多項進(jìn)展，是目前無損分析檢測領(lǐng)域的關(guān)注焦點(diǎn)［4－6］。近年來利用拉曼光譜技術(shù)開展的各項病變組織的檢測和疾病診斷分析引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，也為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)敞開了新的大門，促進(jìn)了疾病診斷技術(shù)的發(fā)展［7］。本文就拉曼光譜在檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用展開綜述。

1拉曼光譜在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用

1．1在病原微生物檢測中的應(yīng)用

微生物細(xì)胞膜表面有大量已知的生化成分可以看作是微生物的特征性標(biāo)志，因而可以作為菌種快速識別和鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用拉曼光譜可以在不依賴培養(yǎng)基的情況下直接對患者體內(nèi)分離下來的或?qū)嶒炇抑斜４娴膯我痪N或混合菌群進(jìn)行快速鑒別及分析［8］。美國華盛頓州的研究人員利用拉曼光譜對從臨床患者和醫(yī)院環(huán)境中分離得到的7株副溶血弧菌進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7株菌株都有其各自不同于其他菌株的特征峰。他們還將其中2株副溶血弧菌菌株分別按照1∶2、1∶1和2∶1的比例混勻后分別利用拉曼光譜檢測，結(jié)果顯示可以通過2株細(xì)菌各自的特征峰將兩者明確區(qū)別開來，其中一株副溶血弧菌的特征峰出現(xiàn)在了1002cm－1、1177cm－1和1532cm－1處，而另一株副溶血弧菌的特征峰卻分別出現(xiàn)在了525cm－1、738cm－1、1319cm－1和1639cm－1處，證明拉曼光譜無論在單一菌種標(biāo)本還是混合菌群標(biāo)本中均具有良好的分析鑒定能力［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合使用拉曼光譜和化學(xué)計量法可以鑒別微生物的種類及各自血清型，已有實驗利用銀納米顆粒作為基底對綠豆芽中的李斯特菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌等6種食物源性致病菌進(jìn)行了拉曼光譜的鑒定和區(qū)分［10］。有研究報道對日常生活中主要的食物源性致病菌進(jìn)行了拉曼光譜分析，從而對細(xì)菌進(jìn)行等級劃分，第一級便是區(qū)分革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，另外通過各自特征峰區(qū)別不同細(xì)菌菌屬，結(jié)果顯示各級的識別結(jié)果準(zhǔn)確度均在91％以上［11］。利用拉曼光譜技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合的辦法，毛麗華等人設(shè)計并建立了拉曼光譜－微流控芯片自動化檢測系統(tǒng)，檢測并統(tǒng)計了珠蛋白生成性障礙貧血型紅細(xì)胞與健康人紅細(xì)胞的拉曼光譜值，通過在1004cm－1、1130cm－1、1450cm－1等拉曼光譜特征峰的數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)了珠蛋白生成障礙性貧血型紅細(xì)胞的血紅蛋白寬度較健康人紅細(xì)胞廣，并以此發(fā)現(xiàn)了新的快速、便捷的檢測珠蛋白生成障礙性貧血的檢驗醫(yī)學(xué)技術(shù)。另有研究者也利用拉曼光譜技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合的辦法從十多種細(xì)菌混合的菌群中對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進(jìn)行了快速分析研究。結(jié)果表明耐甲氧西林金黃色葡萄球菌較其他細(xì)菌有其獨(dú)特的拉曼波峰，并且整個檢測過程用時只需20s時間，在檢驗精度上也與傳統(tǒng)PCR技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)所得到的結(jié)果相似［12］。該方法簡便快速，安全可靠，非常適合用于衛(wèi)生稽查部門的快速檢驗。

1．2在腫瘤檢驗中的應(yīng)用

目前在全世界范圍內(nèi)依然沒有很好的針對腫瘤的治療手段，腫瘤的分期對預(yù)后起著決定性的影響，那么對腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療就擺在了尤為突出的地位［13］。在腫瘤組織中，在細(xì)胞發(fā)生病理學(xué)手段可觀測到的形態(tài)惡變之前，其實已經(jīng)存在由細(xì)胞增殖分裂分化或一些信號蛋白的產(chǎn)生等引起的細(xì)胞中遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂類的結(jié)構(gòu)和含量改變，而這些細(xì)微的改變可以及時通過拉曼光譜檢測反映出來［14］。因而在腫瘤檢驗中拉曼光譜技術(shù)具有傳統(tǒng)病理學(xué)檢測所無法替代的功能用途，對腫瘤的早期診斷有巨大幫助。實驗證明拉曼光譜可用于癌變組織與正常組織的鑒別。早在1991年就有人率先對拉曼光譜的腫瘤檢驗學(xué)價值進(jìn)行了報道。他們發(fā)現(xiàn)正常乳腺組織與腫瘤組織甚至良性腫瘤與惡性腫瘤的拉曼光譜在700～1900cm－1存在著明顯差別，且對應(yīng)的各自拉曼峰相對強(qiáng)度也存在顯著差異［15］。從此掀開了拉曼光譜應(yīng)用于早期腫瘤診斷的新時代。Gawinkowski等［16］對拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)設(shè)計了快速近紅外拉曼光譜檢測系統(tǒng)，進(jìn)一步提高了檢測效率，可在5s內(nèi)快速測得活體皮膚的拉曼光譜。隨即該科研團(tuán)隊利用此系統(tǒng)對肺癌組織進(jìn)行拉曼光譜檢測，結(jié)果顯示肺癌組織的拉曼光譜特征與正常肺組織之間存在明顯差別。此后，該科研小組又成功獲得了亞洲人種皮膚黑色素組織的拉曼光譜數(shù)據(jù)。在對胃癌的在體拉曼檢測中研究人員將拉曼光譜技術(shù)與微型攝像機(jī)、圖像分光儀、雙極管激光發(fā)生器等結(jié)合建立了新型拉曼內(nèi)鏡系統(tǒng)，也推動了內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展［17］。有學(xué)者利用激光作為拉曼光譜的激發(fā)光源，對15例手術(shù)切除且經(jīng)病理確診為基底細(xì)胞癌的組織標(biāo)本進(jìn)行拉曼照射，同時與正常皮膚組織進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示通過拉曼光譜檢測可以實現(xiàn)對基底細(xì)胞癌的高靈敏度診斷［18］。在對鼻咽癌組織和正常鼻咽組織的拉曼光譜比較中也有相似發(fā)現(xiàn)，它們在1290～1320cm－1，1420～1470cm－1和1530～1580cm－1這3處波段區(qū)間均存在明顯特征差異，可以作為鑒別要點(diǎn)。另有研究人員選用830nm波長激光對甲狀旁腺腺瘤組織標(biāo)本及增生組織標(biāo)本中的結(jié)節(jié)區(qū)域進(jìn)行拉曼照射，重復(fù)了四十多次試驗，比較發(fā)現(xiàn)二者的拉曼光譜比較相似，但在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等某些特定波段仍存在可區(qū)別的差異，建立線性分析的數(shù)學(xué)模型可以很好地將二者區(qū)別開來［19］。對人體多處腫瘤組織的拉曼檢測均得到了較好的鑒別指標(biāo)，預(yù)示著拉曼光譜在腫瘤學(xué)檢驗中將有寬廣的發(fā)展空間。

1．3在藥物分析檢測中的應(yīng)用

拉曼光譜較早即應(yīng)用于藥物檢驗領(lǐng)域。早期便有科研人員用共聚焦拉曼光譜儀對鹽酸曲馬多進(jìn)行了檢測，所獲得的拉曼譜帶顯示圖譜峰形良好，峰強(qiáng)明顯，可以較準(zhǔn)確地反映出鹽酸曲馬多的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息［20］。研究人員分析了倍他米松磷酸鈉和地塞米松磷酸鈉這兩種差向異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，分別對其固態(tài)及水溶飽和態(tài)進(jìn)行了常規(guī)拉曼光譜檢測，并進(jìn)一步對以銀膠為基底的這兩種藥物進(jìn)行了增強(qiáng)拉曼光譜檢測分析，成功建立了這兩種差向異構(gòu)體的拉曼區(qū)分系統(tǒng)，可以實現(xiàn)其快速區(qū)分鑒別的目的［21］?？蒲腥藛T采用傅里葉變換拉曼光譜法對不同產(chǎn)地且不同采集時間的野生及人工種植黃芩進(jìn)行了分析研究，結(jié)果顯示利用該方法對中藥材的質(zhì)量鑒定較傳統(tǒng)鑒別方法更快速簡便且不會對受檢樣品造成破壞，值得推廣。有學(xué)者在前人基礎(chǔ)上開創(chuàng)性地將拉曼光譜技術(shù)與光纖傳感技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了甲硝唑片的快速無損鑒別，尤其適合于藥品監(jiān)管部門對藥品快速檢驗。

1．4在眼部疾病檢驗中的應(yīng)用

晶狀體是一具有高濃度蛋白質(zhì)的雙凸面透明組織，其內(nèi)蛋白變化對晶狀體功能改變具有決定性作用，對人眼屈光調(diào)節(jié)也有重要意義。利用拉曼光譜對晶狀體蛋白質(zhì)的亞結(jié)構(gòu)例如：氨基酸亞基、二硫鍵、羧基、巰基等的分析可以幫助人們更好地認(rèn)識晶狀體及其調(diào)節(jié)模式。拉曼光譜技術(shù)引入眼部疾病的研究首先是測定了牛晶狀體中α、β和γ蛋白的拉曼圖譜，結(jié)果顯示α蛋白主要集中于核部而β蛋白主要集中于皮質(zhì)部［22］。Short等［23］測試了紫外線誘導(dǎo)下的兔白內(nèi)障晶狀體拉曼光譜，結(jié)果顯示氨基酸殘基中的羥基譜線強(qiáng)度顯著增加，無法與水形成氫鍵，從而科學(xué)地解釋了白內(nèi)障晶狀體中水分的缺失。與此同時，研究中發(fā)現(xiàn)了多肽水解物的組成成分鄰氨基苯甲酸，暗示著光化學(xué)反應(yīng)可以造成色氨酸殘基的下降。綜合現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)，他們提出了紫外線誘導(dǎo)白內(nèi)障發(fā)生的熱損傷學(xué)說。研究人員測試了誘發(fā)哺乳動物白內(nèi)障的致病性光譜，以6月齡家兔為陰性對照組，以7月齡糖尿病家兔為糖尿病組，對比發(fā)現(xiàn)在900～1700cm－1，并無明顯差異，而在800～850cm－1兩組差異明顯［24］。分析后認(rèn)為誘發(fā)晶狀體混濁的主要原因是α、β和γ晶體蛋白的不良聚合反應(yīng)。

1．5在骨科疾病檢測中的應(yīng)用

絕大部分生物樣本都有自體熒光，而熒光的強(qiáng)背景會對拉曼光譜造成很大的干擾，從而影響拉曼光譜的準(zhǔn)確性。雖然關(guān)于引起骨組織光譜背景的物質(zhì)尚不明確，但很有可能是一些有機(jī)基質(zhì)中的某些非膠原蛋白分子［25］。如果在未處理的情況下，利用拉曼光譜對骨組織的檢測很不準(zhǔn)確。隨后熊義等［26］發(fā)現(xiàn)了通過雙氧水法降低骨組織光譜背景的方法，從而為拉曼光譜在骨組織中的研究打開了大門。骨組織在發(fā)育成熟后其密度與硬度即隨生物力學(xué)環(huán)境的改變而改變，稱為骨重建。在人體整個生命進(jìn)程中，骨質(zhì)會伴隨著有所改變，利用拉曼光譜可以對這一過程進(jìn)行深入研究。一旦吸收與沉積的動態(tài)平衡被打破，則會造成不同類型的骨科疾病。Oshokoya等［27］建立了以拉曼光譜為研究手段的外力作用下的顱縫早閉模型，研究內(nèi)容涉及顱骨成分、骨質(zhì)及基質(zhì)的相對含量和分布。顱縫早閉癥是一種由多病因造成的顱縫發(fā)育異常綜合征，在嬰幼兒屬于常見疾病，由于顱縫過早閉合，限制了顱腔的容積，不利于智力的發(fā)展。結(jié)果顯示在非軸向壓力的作用下成骨區(qū)的前端礦物含量相比無壓力的狀態(tài)下有所下降，其原因可能是礦物沉積不完全［28］。在成骨不全癥的研究中，有學(xué)者利用拉曼光譜證實了成骨不全癥小鼠在6月齡后的骨強(qiáng)度增長不是由于骨形態(tài)改變引起的，而是由于骨基質(zhì)的改進(jìn)而達(dá)成的［29］。

2展望

縱觀歷史，人們已針對各種動物各種組織器官開展了大量的拉曼光譜研究并獲得很多突破性的進(jìn)展，發(fā)明了許多新的檢驗技術(shù)。拉曼光譜在醫(yī)學(xué)檢驗中的作用越來越凸顯，并且越來越多的科技報道證明拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗有其獨(dú)特的優(yōu)勢與特點(diǎn)，諸如快速、準(zhǔn)確、廉價、可靠等。即使前途一片大好，拉曼光譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)中的應(yīng)用仍存在很多問題亟待解決，例如尚未建立不同物質(zhì)的拉曼光譜特征峰信號庫、如何建立針對具體疾病的拉曼檢驗標(biāo)準(zhǔn)、如何建立活體組織的拉曼檢驗系統(tǒng)、如何排除復(fù)雜組織和成分的干擾、怎樣更好地與現(xiàn)行主流檢驗體系相融合等。目前仍留有很多關(guān)鍵性的問題亟待解決，拉曼光譜技術(shù)在檢驗醫(yī)學(xué)中的大面積普及依然任重道遠(yuǎn)。

作者:郭美 魏昆 毛莉 劉曉紅 黃君富 府偉靈 審校 單位:第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗科