茶多酚的提取工藝探究

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在國(guó)內(nèi)外有關(guān)復(fù)合酶解輔助乙醇提取茶多酚的研究少見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合酶解技術(shù)輔助乙醇提取單樅茶中茶多酚，以茶多酚的提取率為參考指標(biāo)，探求酶法輔助乙醇提取茶多酚的最佳工藝條件，為單樅茶中茶多酚的提取提供一種新的方法。

材料與方法

1材料與試劑

單樅茶，興寧市南華現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司；復(fù)合植物水解酶（纖維素酶和果膠酶），酶活力：1500NCU/g，諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；福林酚、碳酸鈉均為分析純，廣州市成碩試劑有限公司。

2儀器和設(shè)備

752N型紫外線可見光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；PL203電子分析天平，梅特勒-托利多；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空抽濾機(jī)，上海亞榮生化儀器廠。

3工藝流程

單樅茶→粉碎→過篩（60目）→酶解預(yù)處理→乙醇提取→抽濾→濾液→含量測(cè)定

4實(shí)驗(yàn)方法

酶添加量的選擇：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于7個(gè)三角瓶中，在酶解pH4.8，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間3h，料液比1︰40，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，提取時(shí)間1h的條件下，考察不同酶添加量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%）對(duì)單樅茶茶多酚提取率的影響。酶解pH值的選擇：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于5個(gè)三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間3h，料液比1︰40，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，提取時(shí)間1h的條件下，考察不同酶解pH（3.2、4.0、4.8、5.6、6.4）對(duì)茶多酚提取率的影響。酶解時(shí)間的選擇：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于5個(gè)三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解溫度50℃，酶解pH4.8，料液比1︰40，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，提取時(shí)間1h的條件下，考察不同酶解時(shí)間（1、2、3、4、5h）對(duì)茶多酚提取率的影響。酶解溫度的選擇：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于5個(gè)三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解pH4.8，料液比1︰40，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，提取時(shí)間1h的條件下，考察不同酶解溫度（30、40、50、60、70℃）對(duì)茶多酚提取率的影響。

乙醇濃度的確定：精確稱取5份同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于最優(yōu)酶解條件（酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時(shí)間3h、酶解pH值4.8）預(yù)處理后，在料液比1︰40，提取溫度70℃，提取時(shí)間1h的條件下，考察不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）對(duì)茶多酚提取率的影響。提取溫度的確定：精確稱取5份同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于最優(yōu)酶解條件（酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時(shí)間3h、酶解pH值4.8）預(yù)處理后，在料液比1︰40，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間1h的條件下，考察不同提取溫度（30、40、50、60、70℃）對(duì)茶多酚提取率的影響。提取時(shí)間的確定：精確稱取6份同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于最優(yōu)酶解條件（酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時(shí)間3h、酶解pH值4.8）預(yù)處理后，在料液比1︰40，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，提取溫度60℃的條件下，考察不同提取時(shí)間（15、30、45、60、75、90min）對(duì)茶多酚提取率的影響。料液比的確定：精確稱取6份同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于最優(yōu)酶解條件（酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時(shí)間3h、酶解pH值4.8）預(yù)處理后，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，提取溫度60℃，提取時(shí)間1h的條件下，考察不同料液比（1︰10、1︰20、1︰30、1︰40、1︰50、1︰60）對(duì)茶多酚提取率的影響。

5測(cè)定方法

茶樣品水分含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[19]，茶多酚含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]。

結(jié)果與分析

1酶解預(yù)處理單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

如圖1~圖4所示，茶多酚的提取率隨著酶添加量增加和酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后基本保持穩(wěn)定的趨勢(shì)，一方面是由于纖維素酶和果膠酶可破壞茶葉的細(xì)胞壁與細(xì)胞間質(zhì)，促使茶多酚等胞內(nèi)物質(zhì)快速擴(kuò)散溶出，提高有效成分的提取率；另一方面是由于酶解反應(yīng)完全，茶多酚充分提取出來，延長(zhǎng)時(shí)間和增加酶添加量，對(duì)提取率的影響不大。茶多酚的提取率隨酶解溫度和pH值呈現(xiàn)先增加后減少的變化規(guī)律。因此，實(shí)驗(yàn)選擇酶添加量的范圍為2.5%~3.5%，酶解時(shí)間為2~4h，酶解pH值為4.0~5.6，酶解溫度為40~60℃，進(jìn)行下一步的正交實(shí)驗(yàn)。

2酶解預(yù)處理正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照盡量減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)和尋求設(shè)計(jì)最優(yōu)的原則，選擇酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量和酶解pH作為因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。極差分析結(jié)果可以看出，對(duì)茶多酚提取率影響最大的是酶解溫度，影響最少的因素是酶解pH值，各因素影響的主次順序?yàn)椋好附鉁囟?gt;酶添加量>酶解時(shí)間>酶解pH值。由k值可以得到最佳組合：A3B3C2D2，即酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時(shí)間3h、酶解pH值4.8。酶解預(yù)處理最優(yōu)條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最高提取率為24.76%。

3乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

如圖5~圖8所示，茶多酚的提取率隨乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比的變化較明顯，茶多酚的提取率隨著乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間升高的變化規(guī)律是先增加后減少；料液比對(duì)茶多酚提取率的影響：當(dāng)料液比為(1︰10)~(1︰40)時(shí)，茶多酚的提取率隨著乙醇溶液體積的增加而增加；當(dāng)料液比為(1︰40)~(1︰60)時(shí)，茶多酚的提取率保持穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)選擇料液比的范圍為1︰30~1︰50，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%~70%，提取溫度為50~70℃，提取時(shí)間為60~90min，進(jìn)行下一步的正交實(shí)驗(yàn)。

4乙醇提取茶多酚工藝優(yōu)化

在前期酶解預(yù)處理的優(yōu)化條件下和乙醇提取茶多酚單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)乙醇提取茶多酚工藝進(jìn)行了正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。影響茶多酚提取率的各因素主次順序是：提取溫度>料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間，極差分析得最佳條件組合為：A3B3C2D3。即提取溫度70℃、料液比為1︰50、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間為1.5h。

5最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)中復(fù)合酶解輔助乙醇提取茶多酚最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于三角瓶中，在酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解pH值4.8、酶解預(yù)處理3h后，轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%、提取溫度70℃、料液比為1︰50的情況下提取1.5h，測(cè)定茶多酚的提取率，2次平行，提取率取平均值為25.82%，均高于單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明此工藝具有一定的合理性。

6水提法與復(fù)合酶解醇提法的比較實(shí)驗(yàn)

從圖9可知，與傳統(tǒng)水提法[21][茶水比1︰15、95℃純凈水2次浸提（第1次、第2次水量分別為總水量的8/15、7/15），每次浸提30min]相比，茶多酚提取率提高了69.87%，且酶解反應(yīng)溫和高效，能保持茶葉茶多酚質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定，提高了單樅茶茶多酚的品質(zhì)，滿足市場(chǎng)需求。因此，復(fù)合酶解輔助乙醇提取法是－種安全可靠的提取方法，具有很好的應(yīng)用前景。

小結(jié)與討論

復(fù)合酶解輔助乙醇提取茶多酚的工藝參數(shù)為：酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時(shí)間3h、酶解pH值4.8、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%、提取溫度70℃、料液比1︰50、提取時(shí)間1.5h，在此工藝條件下，茶多酚的提取率達(dá)25.82%。

目前，茶多酚的提取有熱水浸提法和有機(jī)溶劑萃取法，前者是在相對(duì)高溫長(zhǎng)時(shí)條件下多次浸提茶葉中的茶多酚，存在浸提不充分、高溫長(zhǎng)時(shí)下，茶多酚尤其是兒茶素易氧化生成茶色素，與體系中咖啡堿、蛋白質(zhì)生成茶乳酪，影響茶多酚的生物活性等不足[22]；后者是由于茶葉中的親水性成分大多能在有機(jī)溶劑中溶解，難溶于水的親脂性成分，在有機(jī)溶劑中的溶解性也較大。乙醇是一種毒性小，價(jià)格便宜，來源方便，可回收反復(fù)使用的有機(jī)溶劑，具有提取率高、提取液不易發(fā)霉變質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[23]。與傳統(tǒng)水浸提法相比，酶解輔助乙醇提取法不僅具有高效溫和、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，而且能促進(jìn)茶葉內(nèi)不利及無(wú)效成分的有益轉(zhuǎn)化，改善茶湯的色、香、味、形及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等綜合品質(zhì)，同時(shí)茶多酚提取率比水浸提法高出了69.87%，為茶葉中茶多酚的提取提供了一種新工藝。

雖然酶解結(jié)合醇提法在單樅茶茶多酚的提取方面具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但其應(yīng)用研究還處于實(shí)驗(yàn)室階段，在實(shí)際生產(chǎn)中的推廣與應(yīng)用時(shí)，還有很多工作要做:一是醇提茶多酚安全性評(píng)估需進(jìn)一步深入探討，二是醇提茶多酚溶液中的脂溶性色素較多，給后續(xù)分離純化帶來一定的困難，三是茶多酚中醇味去除關(guān)鍵技術(shù)研究；四是放大參數(shù)及生產(chǎn)設(shè)備都尚須做進(jìn)一步深入研究。（本文作者：謝藍(lán)華、肖南、張嘉怡、江東文、杜冰、楊公明 單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院）