人參果抗腫瘤細(xì)胞研究

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本文作者：李麗靜 張亞杰 劉 佳 吳世佳 張 淞 王 蔚 王 威 王繼彥 單位：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理教研室

人參PanaxginsengC．A．Meyer為五加科人參屬植物，不但其根藥用且其莖葉亦供藥用，并有廣泛的生物學(xué)活性，但果實(shí)研究較少。課題組近10年的研究表明，人參果含有人參皂苷并具有一定的生物活性，從人參漿果中分離得到人參果總皂苷，經(jīng)分離鑒定含有異人參皂苷Rh3、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb1、β-谷甾醇和化合物K等12個(gè)化合物及5個(gè)待鑒定化合物［1、2］。為觀察其抗腫瘤活性及機(jī)制，我們進(jìn)行了如下研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑人參果總皂苷為五加科植物人參PanaxginsengC．A．Mey．的成熟干燥漿果中提取的總皂苷，由課題組化學(xué)組提供。人肺腺癌細(xì)胞(SPC-A1)、人胃腺癌(SGC-7901)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW-111C)和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)等5個(gè)人腫瘤細(xì)胞株購(gòu)自吉林省腫瘤醫(yī)院;噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞礬(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;RPMI-1640為美國(guó)GIBCO產(chǎn)品;胎牛血清(進(jìn)口分裝)、雙抗、谷氨酰胺，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、Hank’液、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。二氧化碳培養(yǎng)箱(ESPECBNA-321D型)、倒置顯微鏡(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社);100級(jí)超凈工作室(蘇州);離心機(jī)(北京離心機(jī)廠);酶標(biāo)儀(BioRad560型);透射電子顯微鏡(TECNAIG2，荷蘭)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)5種腫瘤細(xì)胞株按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、2μmol/L谷氨酰胺、100U/L青霉素、100mg/L鏈霉素RPMI-1640中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3人參果總皂苷對(duì)5種腫瘤細(xì)胞增殖影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108L－1接種于96孔培養(yǎng)板，100μL/孔培養(yǎng)24h后，0.5μg/ml的人參果總皂苷，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(即只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞以調(diào)零)及陽(yáng)性藥物組(5-FU)，每組均設(shè)4復(fù)孔。共同培養(yǎng)48h后，每孔加入20μL的5%MTT，再培養(yǎng)4h棄上清，每孔加入150μL的DMSO振蕩10min，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)吸光度值(A)。按如下公式計(jì)算抑制率:抑制率=(陰性對(duì)照A-樣品A陰性對(duì)照A)×100%。

1.4人參果總皂苷對(duì)5種腫瘤細(xì)胞電鏡形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞以每瓶1×106個(gè)接種于50mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后，加入0.5μg/ml的人參果總皂苷，培養(yǎng)0h、6h、12h、18h、24h和30h后，1500r/min離心5min，收集貼壁及懸浮細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用2.5%戊二醛固定，再用1%鋨酸固定后乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)半薄切片定位后做超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察形態(tài)改變并拍攝照片。

1.5Westernblot免疫印記法檢測(cè)人參果總皂苷對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響0.5μg/ml人參果總皂苷分別作用于SPC-A1細(xì)胞0h、6h、12h、18h、24h，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Western免疫印記法操作，檢測(cè)周期相關(guān)蛋白cyclin及其相關(guān)激酶CDK2和CDK1的蛋白表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)人參果總皂苷對(duì)5種人腫瘤細(xì)胞增殖的影響表1顯示，采用MTT法，人肺腺癌細(xì)胞(SPC-A1)、人胃腺癌(SGC-7901)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW-111C)和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)等5個(gè)人腫瘤細(xì)胞株的作用;0.5μg/ml人參果總皂苷作用于5種人腫瘤細(xì)胞48h，對(duì)5種腫瘤細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用，其中對(duì)SPC-A1細(xì)胞的作用最強(qiáng)。

2.2人參果總皂苷對(duì)SPC-A1細(xì)胞形態(tài)學(xué)電鏡觀察電鏡下觀察，未加藥物組細(xì)胞形態(tài)完整，呈略不規(guī)則形，細(xì)胞表面微絨毛豐富，核呈不規(guī)則形，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)線粒體，嵴清晰，細(xì)胞橋小體使細(xì)胞彼此黏附連接成完整的單層細(xì)胞;加入0.5μg/ml的人參果總皂苷后，隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡改變，藥物作用6h可見(jiàn)細(xì)胞表面微絨毛脫落，核小，胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體腫脹，嵴斷裂，有較多溶酶體產(chǎn)生;藥物作用12h，細(xì)胞表面微絨毛消失，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡狀結(jié)構(gòu);藥物作用18h，細(xì)胞核內(nèi)異染色體趨邊凝聚呈塊狀，并可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)髓樣小體;藥物作用24h、30h，已清晰可見(jiàn)細(xì)胞膜包裹細(xì)胞器或核片段形成典型的凋亡小體。圖1顯示，通過(guò)上述SPC-A1腫瘤細(xì)胞在人參果皂苷0.5μg/ml濃度作用下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(0h、6h、12h、18h、24h和30h)，肺癌細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)比較典型的細(xì)胞凋亡的特征，從形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步證明，人生果皂苷誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡是其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制之一。

2.3Western免疫印記法檢測(cè)人參果總皂苷對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響圖2顯示，0.5μg/ml人參果總皂苷作用0h、6h、12h、18h、24h，隨時(shí)間的推進(jìn)，cyclin和CDK4的蛋白表達(dá)逐漸減少，相關(guān)激酶CDK2和CDK1的蛋白表達(dá)量隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)均有所增加，推測(cè)人參果皂苷可最終引起腫瘤細(xì)胞在G2/M期積累，其誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞凋亡與其影響各周期相關(guān)蛋白和激酶的表達(dá)密切相關(guān)。

3討論

惡性腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制的分裂和增殖。細(xì)胞周期的調(diào)控主要是通過(guò)G1/S、G2/M2個(gè)關(guān)鍵限制點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控。Cyclin-CDK-CKI系統(tǒng)是真核細(xì)胞最重要的細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)，CDK是此系統(tǒng)的中心，cyclin具有正性調(diào)控的作用，而CKI則為負(fù)性調(diào)控因子。cyclin因其在細(xì)胞周期連續(xù)合成不斷積累使活性出現(xiàn)周期性變化而得名，是1組結(jié)構(gòu)類似、能結(jié)合并調(diào)CDK的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為cyclin家族。細(xì)胞周期受細(xì)胞周期蛋白(cyclinB1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)及其抑制劑(CKI)的共同調(diào)控。cyclinB1在G2/M期檢查點(diǎn)發(fā)揮重要作用，其水平升高可使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期的檢查點(diǎn)上［3，4］。CDK是一組絲氨酸-蘇氨酸(Ser-Thr)蛋白激酶，故稱CDK家族。細(xì)胞周期檢查機(jī)制障礙與腫瘤、衰老、凋亡等的發(fā)生有密切關(guān)系。對(duì)于G2/M調(diào)控點(diǎn)而言，其進(jìn)程主要受cyclinB1-CDK1復(fù)合物活性調(diào)控［5］。腫瘤細(xì)胞的G2/M檢查點(diǎn)失控，以致在DNA復(fù)制出現(xiàn)錯(cuò)誤或復(fù)制不全的情況下仍然啟動(dòng)M期。cyclinD1-CDK4復(fù)合物活性，使細(xì)胞阻滯于G1期，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。同樣抑制cyclinB1-CDK1復(fù)合物活性及CDK1蛋白表達(dá)，亦能使腫瘤細(xì)胞阻滯于G2期，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療腫瘤的目的［6，7］。本研究結(jié)果表明，在離體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，人參果皂苷對(duì)5種人腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制作用。對(duì)SPC-A1細(xì)胞的作用最強(qiáng)，可以誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞凋亡;0.5μg/ml人參果總皂苷作用0h、6h、12h、18h、24h，隨著時(shí)間的推進(jìn)，cyclin和CDK4的蛋白表達(dá)逐漸減少，相關(guān)激酶CDK2和CDK1的蛋白表達(dá)量隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)均有所增加，推測(cè)人參果皂苷可最終引起腫瘤細(xì)胞在G2/M期積累，其誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞凋亡與其影響各周期相關(guān)蛋白和激酶的表達(dá)密切相關(guān)。推測(cè)其抗腫瘤作用機(jī)制通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin及其激酶(CDK1、CDK2等)，使腫瘤細(xì)胞堆積于G2/M期，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生而完成抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞的全過(guò)程。