實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)概論精選(九篇)

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第1篇：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)概論范文

關(guān)鍵詞：胃卡他；胃腸炎；腺炎；灌腸療法；喂養(yǎng)護(hù)理要點(diǎn)

中圖分類號(hào)：S858.292 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

1.緒論

犬的消化系統(tǒng)疾病是最常見(jiàn)而最重要的犬類疾病，而這其中大多疾病都是由于其主人缺乏科學(xué)合理的營(yíng)養(yǎng)、喂養(yǎng)、護(hù)理知識(shí)而引起的。尤其是在愛(ài)犬患病或病愈恢復(fù)過(guò)程中，犬的消化功能。必然受到了很大的削弱。由于胃腸功能的削弱及紊亂，犬機(jī)體所攝入的營(yíng)養(yǎng)必然減少，容易對(duì)機(jī)。體產(chǎn)生各種不利的影響。

2.犬易發(fā)的三種消化系統(tǒng)疾病

犬病門(mén)診中，消化系統(tǒng)疾病最為多見(jiàn)，現(xiàn)結(jié)合臨床實(shí)踐，介紹犬易發(fā)的胃卡他、胃腸炎、腺炎三種疾病。

2.1胃卡他

胃卡他是指胃粘膜表面的炎癥，臨床以嘔吐、胃痛、脫水為特征，常呈急性經(jīng)過(guò)。

2.1.1病因

多因一次性過(guò)食難以消化的食物或采食了污穢、腐敗的食物，或食物過(guò)冷過(guò)熱，或喂給刺激性藥物引起。也可繼發(fā)于某些傳染病、寄生蟲(chóng)病等。

2.1.2癥狀

病犬精神沉郁，食欲減退或廢絕，飲欲增加，但喝后即吐，嘔吐頻繁，初吐食糜，以后吐出帶泡沫的粘液。弓背，觸壓腹前部胃區(qū)敏感疼痛，常伸展前肢臥于冷暗處，眼淚增加，舌苔黃白，口臭。嘔吐嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)眼球凹陷、皮膚彈性降低等脫水癥狀。

2.1.3治療

保護(hù)胃粘膜，消除炎癥，糾正脫水及酸堿平衡紊亂。

①禁食。由食物原因引起的胃卡他，應(yīng)禁食24小時(shí)并限制飲水，24小時(shí)后，只給少量溫水、稀飯、溫奶等。

②對(duì)癥治療。維持消化機(jī)能可肌注維生素B100毫克/次，止吐可肌注胃復(fù)安2～4毫升/次，解痙止痛可肌注鹽酸山莨菪堿（654-2）1毫克/公斤體重。脫水嚴(yán)重者，靜脈注射5%葡萄糖生理鹽水50～80毫升/公斤體重，維生素C 0.5克/次，維生素B2毫升，每天1～2次。

③抗菌消炎。肌注慶大霉素或氨芐青霉素1萬(wàn)～2萬(wàn)單位/公斤體重，地塞米松2～4毫克/次。也可并用犬病消，0.3～0.4毫升/公斤體重。

④健胃。病情好轉(zhuǎn)后，可口服多酶片1～2片/次，中藥保和丸1～2丸/次。

2.2胃腸炎

胃腸炎為胃和小腸粘膜及粘膜下組織的重劇炎癥，以腹瀉、腹痛、發(fā)熱、毒血癥為特征。臨床上多見(jiàn)粘液性、出血性胃腸炎。

2.2.1病因

原發(fā)性胃腸炎由單純的胃腸卡他發(fā)展而來(lái)，如采食了發(fā)霉變質(zhì)的肉類、魚(yú)類，很快發(fā)生腹痛、腹瀉、發(fā)熱等癥狀。B族維生素缺乏，機(jī)體抵抗力降低，外感風(fēng)寒也可引起。繼發(fā)性胃腸炎可見(jiàn)于某些病毒?。ㄈ缛翢?、犬細(xì)小病毒病）、細(xì)菌病（如大腸桿菌病、沙門(mén)氏桿菌?。?、寄生蟲(chóng)病（如絳蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)感染）以及濫用抗生素等。

2.2.2癥狀

病初呈急性胃腸卡他癥狀，以后呈胃腸炎癥狀。病犬精神不振，食欲廢絕，嘔吐喜飲，飲后即吐。發(fā)展為腸炎時(shí)，表現(xiàn)頻繁水樣下痢，并混有粘液、血液，體溫升高到40～40.5℃，松弛，排便失禁。隨腹瀉的發(fā)展，病犬眼球下陷，皮膚彈性降低，結(jié)膜發(fā)紺，出現(xiàn)脫水和酸中毒癥狀。

2.2.3治療

排除病因，采取綜合治療措施。

①飲食療法。禁食24小時(shí)，只給少量口服補(bǔ)液鹽飲水，配方為氯化鈉3.5克、碳酸氫鈉2.5克、氯化鉀1.5克、葡萄糖20克、水1000毫升，混合溶解，每次每公斤體重50～100毫升，飲服或灌服。

②對(duì)癥治療。止吐：胃復(fù)安10毫克/次，肌注；止血：止血敏15～20毫克/公斤體重，肌注；增強(qiáng)抵抗力：維生素B100毫克/次，維生素C0.5克/次，肌注；久瀉不止：口服復(fù)方苯乙哌啶片2.5毫克/次，一日2～3次。

③強(qiáng)心，補(bǔ)液，防止酸中毒。5%葡萄糖生理鹽水50毫升/公斤體重，50%葡萄糖10～20毫升，維生素C0.5克，鹽酸山莨蓉堿1毫克/公斤體重，混合靜注。心衰時(shí)加入10%安鈉咖0.5～2毫升。伴隨酸中毒時(shí)，可將5%碳酸氫鈉注射液按3～5毫升/公斤體重用5%葡萄糖稀釋至1.25%，靜脈注射。

2.3腺炎

是犬腺排泄管阻塞，分泌物積聚，發(fā)生感染而引起的炎癥。

2.3.1病因

犬腺位于內(nèi)外括約肌之間的腹側(cè)，呈球形，直徑約1厘米，左右各1個(gè)。腺以2～4厘米長(zhǎng)的管道開(kāi)口于粘膜與皮膚交界處，相當(dāng)于時(shí)鐘4點(diǎn)和8點(diǎn)的位置，將犬尾提起易看到。其分泌物為灰色或褐色油脂狀，具強(qiáng)烈臭味。當(dāng)腺過(guò)度分泌時(shí)，腺導(dǎo)管阻塞或括約肌功能不良，均易致腺體內(nèi)分泌物滯留，引起感染、發(fā)炎、腫脹。

2.3.2癥狀

早期患犬表現(xiàn)不安，食欲減少或廢絕，不斷回頭試圖啃、舔部位，或后軀坐地有擦肛動(dòng)作。有的病犬排糞困難，不時(shí)努責(zé)但僅能排出少量干硬糞便。日久則紅腫，向外突出，流灰褐色液體，附近有多量灰褐色分泌物附著。擠壓腺，可從中排出多量灰褐色液體，有的呈化膿性感染，形成膿腫，易破潰與外界相通。

2.3.3治療

徹底擠出腺內(nèi)液體，并用生理鹽水或0.1%高錳酸鉀溶液反復(fù)沖洗，然后注入青霉素溶液10萬(wàn)～20萬(wàn)單位。也可用慶大霉素8萬(wàn)單位、2%鹽酸普魯卡因4毫升混合注入腺內(nèi)。配合肌注清開(kāi)靈、犬病康等，效果更好。

3、巧用灌腸療法治療犬消化系統(tǒng)疾病

在寵物治療中最多碰到是犬的消化系統(tǒng)疾病,針對(duì)病情采用的簡(jiǎn)單的灌腸法可收到了不錯(cuò)的效果。

3.1灌腸療法的適用范圍

①犬表現(xiàn)為上吐下瀉,糞便帶血腥臭等腸胃炎癥狀時(shí),可以應(yīng)用灌腸療法進(jìn)行治療,排除稀糞,清空腸道,直腸直接給藥。

②犬發(fā)生大便干燥，排便困難等糞便秘結(jié)時(shí)，可應(yīng)用灌腸治療軟化糞便，腸道。

③犬表現(xiàn)強(qiáng)烈的嘔吐，食欲廢絕，按壓腹壁可以摸到香腸狀的有彈性的硬物等腸套疊癥狀時(shí)，可以用深部灌腸法來(lái)治療。

④在犬口服給藥困難的情況下，可以用直腸灌腸進(jìn)行給藥。

3.2具體操作方法

取輸液空瓶一只，內(nèi)裝溫?zé)醄35度左右]的灌腸液，安裝上輸液器，把輸液器下方的連接頭剪去，將塑料管的端插入人用14號(hào)導(dǎo)尿管中。打開(kāi)輸液開(kāi)關(guān)，檢查插頭處是否漏水，如有漏水，可將塑料管再向內(nèi)插緊，關(guān)上輸液開(kāi)關(guān)。

將犬俯臥保定在治療臺(tái)上，把治療臺(tái)的后兩只腿墊起，使犬呈前低后高的。如果犬較為馴服，可讓其站立進(jìn)行灌腸。剪去犬周?chē)奈蹪岜幻?，把?dǎo)尿管的圓頭端從插入，邊插邊放液，以腸道易于插入。盡量多地插入導(dǎo)尿管，尤其是作保留灌腸時(shí)，利于藥物深入腸管。如發(fā)現(xiàn)堵塞，可來(lái)回抽動(dòng)導(dǎo)尿管，或讓犬將積糞排除后再繼續(xù)灌腸。

作用是通便驅(qū)氣和清潔腸道。灌腸溶液較大，一般一次用量250-1000毫升[根據(jù)犬體形大小而定]，常將溶液瓶抬高，使罐入壓力增大，灌腸速度較快。灌完后立即讓犬排泄。

3.2.1留液灌腸法

作用是輸入治療藥物，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或軟化硬結(jié)的糞便，灌腸速度不宜過(guò)快，溶液量不宜過(guò)大，灌完后仍保持前低后高的，并用犬尾根堵塞一段時(shí)間。在做輸入藥物和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保留灌腸之前，最好先用溫水進(jìn)行洗腸，將積糞排出。

3.2.2常用的灌腸溶液

①生理鹽水刺激性輕，可用于腸道有疾患的清腸通便。

② 0.1%-0.2%肥皂水（在開(kāi)水中加入肥皂至乳白色為止），用于手術(shù)前清腸或分娩前催產(chǎn)，同時(shí)可起驅(qū)氣作用。

③松節(jié)油溶液（松節(jié)油4毫升加入500毫升肥皂水?dāng)噭颍?，可以?qū)出腸內(nèi)積氣。

3.2.3留液灌腸的灌腸液

①在生理鹽水中加入抗菌消炎藥物，可以治療急慢性腸炎。

②30-60毫升甘油或植物油，加溫水至100-200毫升[盛和林等編著：哺乳動(dòng)物學(xué)概論，華東師范出版社，1985]；用5%硫酸鎂30毫升、甘油60毫升，加入90毫升溫水配制成1：2：3灌腸液；用食鹽10克溶于100毫升溫水中，配制成10%高滲鹽水，可以用來(lái)軟化糞便，腸道，促使積糞排出。

③5毫升地塞米松、10毫升安痛定、40毫升魚(yú)腥草，加生理鹽水100毫升，配制成混合溶液，可以用來(lái)治療犬的各種高熱，能起到迅速退熱的作用。

④生理鹽水200毫升加入安乃近5毫升或加入0.5%阿托品1毫升，深部灌腸，可治療早期的腸套疊，緩解腸痙攣，減輕疼痛，充盈腸管，可使套疊的腸管復(fù)位。

4、預(yù)防犬消化系統(tǒng)疾病的常識(shí)

犬的消化系統(tǒng)疾病是最常見(jiàn)而最重要的犬類疾病，而這其中大多疾病都是由于其主人缺乏科學(xué)合理的營(yíng)養(yǎng)、喂養(yǎng)、護(hù)理知識(shí)而引起的。尤其是在愛(ài)犬患病或病愈恢復(fù)過(guò)程中，犬的消化功能 必然受到了很大的削弱。由于胃腸功能的削弱及紊亂，犬機(jī)體所攝入的營(yíng)養(yǎng)必然減少，容易對(duì)機(jī) 體產(chǎn)生各種不利的影響。因此，主人在平時(shí)的喂養(yǎng)管理、患病期間及恢復(fù)過(guò)程應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

4.1健康犬只平時(shí)的喂養(yǎng)管理要點(diǎn)

4.1.1幼犬（出生-8月齡）

剛出生的幼犬由于其消化器官還未完全發(fā)育成熟，其消化能力極其有限，胃腸只能消化母乳。因而1月齡以內(nèi)的幼犬最好喂母乳。在喂乳時(shí)可加入少許酵母片的水溶液，以幫助幼犬更好地消化吸收母乳。同時(shí)，喂母乳宜分多次進(jìn)行，一般每天可以分6~8次喂食。

為了你的幼犬健康，請(qǐng)堅(jiān)持母 乳哺乳幼犬原則。小犬?dāng)嗳楹?，其身體的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是自身骨骼、牙齒的生長(zhǎng)形成往往需要充足而均衡的營(yíng)養(yǎng)。特別是對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、微量元素及維生素等的需求較迫切，這些物質(zhì)需求的滿足與否會(huì)直接關(guān)系其日后能否長(zhǎng)成一條健康體美的成犬。

普通的食物則很難完全搭配滿足到幼犬的營(yíng)養(yǎng)需要，這就需要給你的愛(ài)犬提供專門(mén)配置的優(yōu)良犬糧了。因此，市面提供的各種專業(yè)特制的幼犬糧不妨用間隔搭配的方法喂給犬。這對(duì)減少幼犬胃腸道疾病和日后更好、更快的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生極為重要的作用。

此外，該時(shí)期幼犬的胃腸道疾病也可能由體內(nèi)腸道寄生蟲(chóng)和感染外界的細(xì)菌、病毒引起。最常見(jiàn)的腸道寄生蟲(chóng)是蛔蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)和鞭蟲(chóng)，因而每月定期預(yù)防性驅(qū)蟲(chóng)是必要的。而細(xì)菌性胃腸道病則多是在機(jī)體勞累、衰弱、抵抗力下降時(shí)，被致病性菌種經(jīng)污染的食物、呼吸道等途徑入侵感染而致病的。因而，在日常喂養(yǎng)管理上應(yīng)盡量保持犬食的清潔衛(wèi)生，喂食時(shí)要做到定時(shí)、定量、定質(zhì)的原則。對(duì)于病毒性胃腸道疾病，免疫接種是最安全和有效的預(yù)防解決辦法。一般確認(rèn)有效的免疫 程序是在小犬滿2個(gè)月齡的時(shí)候進(jìn)行首次免疫接種疫苗，必要時(shí)可以21日的間隔時(shí)段再注射2針，以確保幼犬獲得足夠的機(jī)體保護(hù)力。

許多其它因素也會(huì)直接或間接地誘發(fā)消化道的疾病，因而主人應(yīng)盡量避免犬只受到這些因素的影響。最常見(jiàn)是因天氣突然變化、洗澡或吹冷氣等引起的受凍感冒，又或者是食物轉(zhuǎn)變過(guò)快引發(fā)的胃炎。幼犬的食物應(yīng)盡量煮熟后方可食用，食用時(shí) 可加入些許含碘食鹽，以幫助其調(diào)節(jié)胃口。切記不要讓犬吃生雞蛋、生肉、生肝及油膩的食物。

4.1.2成犬（8月齡-5歲）

對(duì)于生長(zhǎng)的犬來(lái)說(shuō)，其消化功能日趨完善，有較強(qiáng)的消化吸收能力，故其消化道疾病發(fā)病率也逐漸降低，但犬主也不應(yīng)因此而放松對(duì)愛(ài)犬的護(hù)理。這個(gè)時(shí)期的胃腸道疾病多是繼發(fā)于一些傳 染病或內(nèi)科病，例如：由于主人粗心喂了大塊骨頭而導(dǎo)致便秘或腸梗塞，犬細(xì)小病毒病引起出血 性腸食炎，過(guò)引起反復(fù)性胃腸炎等。

4.1.3老年犬（5歲以上）

當(dāng)你的伴侶動(dòng)物進(jìn)入了老年期，它的消化、吸收能力將大大減退。同時(shí)伴隨其牙齒的磨損、脫落，食物若過(guò)難咀嚼完全則會(huì)對(duì)其消化系統(tǒng)增加負(fù)擔(dān)而導(dǎo)致胃腸道疾病的發(fā)生。老年犬易發(fā)生 便秘和消化不良等胃腸道功能紊亂疾病。為了避免這些疾病，對(duì)老年犬的喂養(yǎng)宜定時(shí)、少量，食 物要保證衛(wèi)生干凈、易消化。特別要注意多吃一些富含維生素及微量元素的物質(zhì)，例如水果、鈣 片、肝臟等。尤其要注意的是讓老年犬多些運(yùn)動(dòng)和提供充足的飲水。

4.2患有消化道疾病或病愈恢復(fù)期的犬只的喂養(yǎng)護(hù)理要點(diǎn)

①給予容易消化的流體食物，如：稀肉粥，肝臟拌稀飯，菜肉湯等。

②適當(dāng)在犬食中加入少量健胃消食的保健性藥物或一些維生素，如：酵 母片、維生素 C片、魚(yú)肝油丸等。

③盡量避免過(guò)食，不要給予高脂肪、高蛋白，難以消化和加重胃腸負(fù)擔(dān)的食物。

④每天喂食要少量多餐，同時(shí)要努力做到定時(shí)、定量、定質(zhì)的大原則。

⑤患病期間應(yīng)盡量減少洗澡的次數(shù)，以及加強(qiáng)保溫護(hù)理工作。

⑥患便秘的犬只應(yīng)給予充足的飲水和運(yùn)動(dòng)，以促進(jìn)胃腸的蠕動(dòng)、排空，減少食物在胃 腸內(nèi)的積壓負(fù)擔(dān)。

⑦主人要多留意患病犬的飲食次數(shù)、食量、飲食欲，以及排便或尿的次數(shù)及其性狀。

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第2篇：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)概論范文

關(guān)鍵詞　Mef2；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號(hào)　R39211 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼　A 文章編號(hào)　10002537（2012）05006404

Mef2屬于MADS家族轉(zhuǎn)錄因子基因，MADS家族是指其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子的總稱［1］．MADS結(jié)構(gòu)域是一種DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由55～63個(gè)氨基酸組成，所識(shí)別并結(jié)合的DNA保守序列為CArG框［CC（A/T）6GG］．

Mef2位于果蠅2號(hào)染色體上，mRNA全長(zhǎng)5　990　bp，編碼501個(gè)氨基酸．脊椎動(dòng)物有4種MEF2蛋白（MEF2AD），而果蠅中只有1種MEF2蛋白（DMEF2）［2］．不管是脊椎動(dòng)物還是果蠅中的MEF2蛋白都含有一個(gè)高度保守的MADS和MEF2結(jié)構(gòu)域，并且由它們來(lái)介導(dǎo)DNA結(jié)合、二聚作用、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用［3］．

Mef2最初是在分化的肌肉細(xì)胞中作為一個(gè)肌肉特異結(jié)合的活性因子被鑒定的，1997　年卻發(fā)現(xiàn)Mef2基因在心臟發(fā)育的過(guò)程中起重要作用［4］．在果蠅中，Mef2首先在原腸胚形成時(shí)在整個(gè)中胚層中表達(dá)，隨著胚胎的發(fā)育，它的表達(dá)逐漸限制在體節(jié)、內(nèi)臟和心肌細(xì)胞中［56］．鑒于Mef2基因在果蠅心臟發(fā)育的過(guò)程中起著重要的作用［7］，所以制備一個(gè)特異性好的多克隆抗體尤其重要，對(duì)進(jìn)一步以果蠅為模型研究Mef2基因具有重要的意義．

1.1　實(shí)驗(yàn)材料和試劑

大腸桿菌Rosseta菌種，pET28a菌種以及coli　DH5α菌種為本實(shí)驗(yàn)室提供；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，DNA、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker，Tag　DNA聚合酶購(gòu)自深圳晶美公司；pMD18T載體和連接酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；UNIQ10柱式DNA　膠回收純化試劑盒購(gòu)自上海生工公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Glutathione　SepharoseTM　4B蛋白純化試劑盒購(gòu)自PIERCE公司；弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、IPTG（異丙基βD硫代半乳糖苷）等購(gòu)自上海Sangon公司；新西蘭大白兔購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部．

1.2　引物設(shè)計(jì)與合成

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ncbi.nlm.nih.gov）檢索出果蠅Mef2基因的序列，根據(jù)巢式PCR的原理利用Primer　Premier　5．0　軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：第一對(duì)：DMef2S1：5′CGCCAGCTGCCGGAAATCCA　3′；DMef2A1：5′GCGTCTGCAGCGTGACCACT　3′．第二對(duì)（分別加入EcoR　Ⅰ和Xho?、衩盖形稽c(diǎn)）：DMef2S2：5′GAGAATTCATGGGCCGCAAA　AAAATTCA　3′　EcoR　Ⅰ；DMef2A2：5′GGCTCGAGGTGGACTGGCCTGCAGCAGG　3′　Xho?、瘢?/p>

1.3　基因克隆和載體構(gòu)建

選取30只野生型果蠅，液氮冷凍30　min，用Trizol法提取總RNA［8］，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，獲得firstchain　cDNA．然后以firstchain　cDNA為模板用第一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后以所得產(chǎn)物為模板，用第二對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段［9］．目的片段經(jīng)純化后克隆入T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，酶切檢測(cè)篩選出陽(yáng)性單克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定后將DN段從pMD18TMef2質(zhì)粒上切下，連入pET28a載體（EcoRⅠ和XhoⅠ酶切線性化），得到陽(yáng)性克隆，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28aMef2．

1.4　Mef2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

pET28aMef2重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株Rosseta，篩選出陽(yáng)性菌落，然后接種于LB　培養(yǎng)基（含100　mg/L　氯霉素，卡那霉素）37　℃　培養(yǎng)12　h左右，以1∶　50轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6，按0.1　mol/L　加IPTG，25　℃誘導(dǎo)，4、5、6、7　h各取1　mL菌液，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間．

收集誘導(dǎo)后大腸桿菌，PBS漂洗后超聲裂解，離心取上清．4　℃下與經(jīng)Binding　Buffer漂洗活化后的NiIDA凝膠柱結(jié)合，Washing　Buffer洗去雜蛋白，Elution　Buffer洗脫目的蛋白，獲得純化的HisMef2融合蛋白，-80　℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.5　Mef2多克隆抗體制備

將純化后的HisMef2蛋白與弗氏完全佐劑按體積1∶　1在注射器中推成乳劑，分散約12個(gè)點(diǎn)對(duì)同一新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下免疫注射．在第一次注射后14、21、28　d，將HisMef2蛋白按體積比1∶　1與弗氏不完全佐劑在注射器中推成乳劑，進(jìn)行多次免疫．第35天主動(dòng)脈取血，靜置過(guò)夜（4　℃），3　000　r/min離心處理10　min，取上清分裝保存（-80　℃）．

1.6　效價(jià)測(cè)定

獲得免疫兔血清后，用誘導(dǎo)的總蛋白進(jìn)行Western　blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)．將含pET28aMef2重組子的菌株在LB培養(yǎng)液中37　℃培養(yǎng)，將5　mL接種于200　mL新鮮培養(yǎng)基中，用IPTG在25　℃條件下誘導(dǎo)5　h后，收集細(xì)菌，PBS重懸，然后用SDSPAGE電泳分離．將Mef2抗體分別以1∶　100、1∶　500、1∶　1　000和1∶　2　000的體積比稀釋后，以免疫前兔血清作為對(duì)照，采用Western　blotting方法檢測(cè)抗體的特異性［10］．

2　結(jié)果與分析

2.1　重組質(zhì)粒pET28aMef2的構(gòu)建與鑒定

將純化后的果蠅Mef2基因片段克隆到pMD18T載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定與基因理論序列100%匹配，然后用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，連入pET28a載體（EcoRⅠ和XhoⅠ酶切線性化），獲得重組質(zhì)粒pET28aMef2．經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒正確（圖1）．

2.2　Mef2　融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組子轉(zhuǎn)入Rosseta感受態(tài)細(xì)胞中，以0.1　mmol/L　IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，30　℃條件下進(jìn)行時(shí)間梯度誘導(dǎo)1，2，3，4，5，6　h分別取樣檢測(cè)蛋白的表達(dá)，結(jié)果（如圖2）顯示Mef2蛋白在誘導(dǎo)1　h后就開(kāi)始表達(dá)，隨著時(shí)間推移表達(dá)量增加，在3　h后趨于穩(wěn)定．

3　討論

為了以果蠅為模型進(jìn)一步研究Mef2基因的功能，本文通過(guò)試驗(yàn)獲得了Mef2原核表達(dá)融合蛋白，制備了高效價(jià)和特異性好的兔抗Mef2血清．在獲得融合蛋白的過(guò)程中，先通過(guò)軟件分析選取了親水性好而又含結(jié)構(gòu)域少的一段序列，為獲得特異性好的抗體提供了前提條件［12］．在誘導(dǎo)蛋白的過(guò)程中，IPTG　的終濃度選取的是0.1　mmol/L　，蛋白表達(dá)量相對(duì)高，又不至于因IPTG　濃度太高對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒性作用，試驗(yàn)相對(duì)容易成功．

pET28a（+）載體是一種常用的原核表達(dá)載體，具有Kan抗性，質(zhì)粒大小為5.3　kb．載體的N端攜帶His標(biāo)簽、凝血酶基因及T7啟動(dòng)子標(biāo)簽序列；在C端具有His標(biāo)簽序列，　pET28a（+）載體可在BL21（DE3）、Rosstea等表達(dá)菌株中高表達(dá)融合有His標(biāo)簽的蛋白，便于下游蛋白純化．pET28a這種載體沒(méi)有本身溶解性高的多肽融合蛋白，也沒(méi)有催化二硫鍵形成的酶融合蛋白，而且不含信號(hào)肽序列，所以同一種蛋白用這個(gè)載體，形成包涵體的可能性更大些［13］．

本試驗(yàn)中，作者通過(guò)構(gòu)建pET28aMef2重組質(zhì)粒、誘導(dǎo)表達(dá)HisMef2融合蛋白獲得了高純度的蛋白并免疫新西蘭大白兔制備了Mef2抗體．通過(guò)效價(jià)檢測(cè)證明制備的Mef2多克隆抗體具有較好的特異性，能滿足試驗(yàn)要求．　因此，它為將來(lái)運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫組化等手段深入研究Mef2基因的功能奠定了基礎(chǔ)．

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