分子生物學(xué)研究精選(九篇)

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第1篇：分子生物學(xué)研究范文

關(guān)鍵詞：羊草；分子生物學(xué)；遺傳多樣性；組織培養(yǎng)；基因克隆

中圖分類號(hào)：S543.901　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A　文章編號(hào)：1007-7847(2007)04-0289-06

羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科賴草屬草本植物，由于其環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)。具有耐寒、耐旱、耐鹽堿等優(yōu)點(diǎn)而成為松嫩平原的優(yōu)勢(shì)物種，同時(shí)羊草也是一種重要的牧草資源，蛋白質(zhì)含量高，適口性好，耐踐踏，在發(fā)展草原畜牧業(yè)方面具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，但羊草種子發(fā)芽率低、種子萌發(fā)最適pH值為8.0～8.5，加上過變放牧和草地鹽堿化日益加重等原因，我國(guó)現(xiàn)存系統(tǒng)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(K09M6)羊草草地約有90％以上發(fā)生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遺傳分化、抗逆機(jī)理、栽培育種以及轉(zhuǎn)基因等對(duì)于改善生態(tài)環(huán)境和草場(chǎng)建設(shè)具有重要意義，隨著分子生物學(xué)對(duì)各個(gè)學(xué)科的交叉滲透，使羊草的研究從細(xì)胞水平進(jìn)一步深入到分子水平，羊草屬于異交植物，物種趨向于在種群中具有較高水平的變異性，僅在松嫩草原中西部靠近內(nèi)蒙古高原東部草原上的羊草種群就數(shù)以千計(jì)，這為研究羊草種群的遺傳多樣性提供了對(duì)象，培養(yǎng)愈傷組織是進(jìn)行羊草轉(zhuǎn)基因研究的前期工作，但誘導(dǎo)率低的問題尚未得到解決，筆者結(jié)合自己的科研工作，對(duì)羊草分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究成果加以綜述，旨為羊草抗逆分子機(jī)理研究提供參考資料。

1　羊草遺傳多樣性研究

由于羊草生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)、分布范圍廣、生境類型多樣，在長(zhǎng)期的適應(yīng)和進(jìn)化過程中，羊草種群之間在形態(tài)、生理、生態(tài)以及遺傳特征方面均產(chǎn)生了趨異，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA)技術(shù)可以在對(duì)被檢對(duì)象無任何分子生物學(xué)資料的情況下對(duì)其基因組進(jìn)行分析，而且具有費(fèi)用較低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和實(shí)驗(yàn)操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增酶切片段多態(tài)性)、SSR(simple sequence rc-peat，微衛(wèi)星重復(fù)序列)等分子標(biāo)記更加簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，從而使其成為目前研究羊草遺傳多樣性的最重要的手段之一，該技術(shù)主要是利用各種群羊草的總基因組DNA作為模版，篩選能夠擴(kuò)增出具有明顯差異性條帶的隨機(jī)引物，以至少兩次重復(fù)均出現(xiàn)的結(jié)果做0，1矩陣圖，即有條帶記為1，無條帶記為0，計(jì)算總片段數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)百分率、各種群間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，利用分析軟件進(jìn)行聚類分析從而得到其遺傳結(jié)構(gòu)樹狀圖，

羊草RAPD分析可以用于研究羊草的種群關(guān)系以及遺傳分化的影響因子，崔繼哲等應(yīng)用RAPD技術(shù)證明相似生境或同一地域的種群在一些位點(diǎn)上表現(xiàn)出相似或相同的變化，劉惠芬等運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古典型草原不同生境8個(gè)羊草種群進(jìn)行分析，聚類結(jié)果顯示生境相似的種群能夠聚在一起，而地理距離最近的種群不一定歸為一類，說明小范圍內(nèi)羊草種群間的遺傳分化與地理距離不存在相關(guān)性，而與其生境間的相似度相關(guān)，影響遺傳相似性的不是單一因子而是各種因子的綜合作用，較小地理范圍內(nèi)羊草種群間的遺傳分化主要是由環(huán)境的異質(zhì)性所引起的，筆者曾以采自中國(guó)大安堿地生態(tài)試驗(yàn)站(N45°36′，E123°53′)的羊草種子單株播種栽培，以每株羊草幼苗的地上部為材料進(jìn)行RAPD分析，30個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的平均遺傳距離為0.1909，共可分為4個(gè)類群(待發(fā)表)，通過RAPD分析，還可以進(jìn)一步將羊草遺傳分化多樣性的原因具體化，汪恩華等””利用分子標(biāo)記與形態(tài)標(biāo)記以21個(gè)有效隨機(jī)引物中對(duì)9份羊草材料進(jìn)行RAPD分析，對(duì)隨機(jī)抽取的17份禾草種質(zhì)進(jìn)行了種質(zhì)評(píng)估的比較研究，結(jié)果表明，羊草種質(zhì)的小穗數(shù)、種子千粒重、葉色、有性繁殖量和結(jié)實(shí)率5個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)與遺傳多樣性指標(biāo)存在一定的相關(guān)性，應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)不同生境羊草在水分脅迫下游離脯氨酸含量的變化做聚類圖比較分析，證實(shí)水分是影響羊草種群間遺傳變異和生態(tài)型分化的一個(gè)最主要的因子，雖然水因子是影響羊草分化的一個(gè)主導(dǎo)因子，但是在實(shí)際研究工作中也認(rèn)識(shí)到羊草變異和分化是多種生態(tài)因子綜合起作用的結(jié)果(如溫度、海拔、經(jīng)緯度、土壤類型等)，而且各因子之間又是相互影響，在不同的生境中限制因子又是變換的，這就造成不同地理種群的羊草遺傳分化過程的復(fù)雜性，由此可見，目前以羊草為實(shí)驗(yàn)材料的RAPD分析雖有許多報(bào)道。但是由于羊草本身具有較高的種群變異性。組成羊草群落的植物總計(jì)有357種，加之尚缺乏一種統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)分型方法，因此RAPD技術(shù)就成為研究羊草分類及來源的主要工具，在物種鑒定及遺傳分化研究中發(fā)揮著重要作用。

除了RAPD技術(shù)以外，等位酶技術(shù)也可用于羊草遺傳多樣性分析，等位酶是指由一個(gè)位點(diǎn)的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同，崔繼哲等通過該技術(shù)，綜合分析了松嫩平原11個(gè)羊草種群的遺傳多樣性及遺傳分化指標(biāo)，深入剖析了灰綠型和黃綠型兩種葉色類型羊草種群之間的遺傳差異，證明種群間的遺傳距離與地理距離之間沒有相關(guān)，崔繼哲等還采用淀粉凝膠電泳技術(shù)，應(yīng)用等位酶分析方法測(cè)定了松嫩平原南部微生境下羊草灰綠色和黃綠色兩種生態(tài)型9個(gè)種群的遺傳多樣性和遺傳分化程度，證明羊草種、種群和生態(tài)型水平都維持較高的遺傳多樣性，兩種生態(tài)型之間有明顯的遺傳多樣性差異及遺傳分化，另外，對(duì)不同生境、不同分類種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)羊草種群遺傳變異度很高，但是無論如何歸屬，松嫩草原上的羊草種群遺傳分化程度很低，推測(cè)可能與羊草為異花授粉、不同類型混生及種群間基因流強(qiáng)度大有關(guān)，劉杰等曾用SSR作為探針構(gòu)建了羊草的遺傳指紋圖譜，為羊草種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、種間及種內(nèi)親源關(guān)系分析、生物多樣性研究提供了有效手段，利用AFLP方法對(duì)我國(guó)不同地區(qū)分布的羊草材料進(jìn)行的DNA多態(tài)性分析結(jié)果也表明了羊草基因組DNA具有比較豐富的多態(tài)性。

2 羊草愈傷組織培養(yǎng)及利用

植物組織細(xì)胞培養(yǎng)(plant tissue and cell cul-ture)是通過運(yùn)用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)植物育種獲得新品種的一條快捷途徑，既可以通過

花粉培養(yǎng)、未授粉子房以及胚株培養(yǎng)等誘導(dǎo)形成單倍體植物，也可以通過植物愈傷組織培養(yǎng)中普遍存在的染色體變異實(shí)現(xiàn)植物突變育種，另外，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行的植物細(xì)胞融合(尤其是原生質(zhì)體融合)、胚胎培養(yǎng)以及植物體外受精技術(shù)可獲得遠(yuǎn)緣雜交種，通過植物組織培養(yǎng)中的莖尖培養(yǎng)能夠產(chǎn)生無病毒原種，因而可用于植物脫毒，解決生產(chǎn)實(shí)踐中植物病毒危害問題，組織培養(yǎng)是植物細(xì)胞工程學(xué)、遺傳學(xué)、植物生理學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，不僅用于快速繁殖。還用于單倍體育種、種質(zhì)保存、生理學(xué)研究和基因轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域。

早在上世紀(jì)80年代，高天舜就利用羊草根莖作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生材料，目的是為了改良羊草的遺傳性狀，試圖通過組織培養(yǎng)途徑獲得羊草新類型，該研究采用當(dāng)年生羊草根莖幼嫩部分的節(jié)間基部切段以及隔年生老根莖和當(dāng)年生根莖的芍間中部、頂部切段作為外植體，消毒處理后接種于3種MS培養(yǎng)基中，先進(jìn)行暗培養(yǎng)。待長(zhǎng)出愈傷組織后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)率平均在20％左右，分化率最高也只有24.2％，羊草幼穗和成熟種子也可作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，劉公社等，以幼穗作為外植體，恒溫25℃條件下誘導(dǎo)愈傷組織，在加有1mg/L2，4-D MS培養(yǎng)基上繼代2次后，轉(zhuǎn)移到含1.0mg/L KT和0.5mg/NAA的MS培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)得到再生芽，并在無激素的基本培養(yǎng)基上獲得了生根的試管苗，移栽到溫室后可正常生長(zhǎng)，盡管從羊草葉片、幼穗和成熟胚在同樣培養(yǎng)條件下均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但只有幼穗愈傷組織能夠繼續(xù)分化出再生植株，但分化率因基因型和外源激素的不同而不同，以成熟羊草種子為外植體誘導(dǎo)愈傷組織具有操作簡(jiǎn)便、污染程度低、材料選擇直觀化的優(yōu)點(diǎn)，且誘導(dǎo)率和幼苗分化率較高、幼苗健壯、生長(zhǎng)勢(shì)好，崔秋華等采用3種培養(yǎng)基(MS、B5和8114)，3種2，4-D的濃度水平(1、2、4 mg/L)培養(yǎng)羊草幼嫩根莖和種子，結(jié)果表明，以種子作為外植體可獲得較高的愈傷組織誘導(dǎo)率(29.05％)，但目前對(duì)于最適激素濃度沒有統(tǒng)一結(jié)論，其范圍從1～4mg/L不等，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果也未達(dá)到令人滿意的水平，仍需要深入研究。

在對(duì)羊草愈傷組織的應(yīng)用方面，可以以羊草種子誘導(dǎo)出的愈傷組織為材料，用含有NaCl的培養(yǎng)基和含有NaHCO3與Na2CO3的混合鹽培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定羊草愈傷組織的耐鹽性，結(jié)果表明羊草愈傷組織對(duì)NaCl最大耐受強(qiáng)度為180mmol/L；對(duì)NaHC03與Na2CO3的混合鹽的最大耐受強(qiáng)度為4mmol/L中性鹽(NaCl)與堿性鹽(NaHCO3與Na2CO3)對(duì)羊草愈傷組織的脅迫機(jī)制明顯不同，國(guó)內(nèi)外對(duì)于愈傷組織的培養(yǎng)大多應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因，但在羊草方面進(jìn)行的該項(xiàng)研究卻很少，劉公社將攜帶PAT基因的質(zhì)粒通過基因槍法轉(zhuǎn)化羊草愈傷組織。然后在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選抗性愈傷組織并轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，得到再生苗，然后接種到含有篩選劑的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)后得到轉(zhuǎn)基因羊草小苗，該研究已獲得耐除草劑的羊草新品種專利，曲同寶等用基因槍將BADH基因轉(zhuǎn)入由羊草成熟胚誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過PCR檢測(cè)證明外源基因已整合到羊草基因組中并得以表達(dá)，雖然轉(zhuǎn)入羊草的基因都可被檢測(cè)到已整合人羊草基因組中，而且也得到表達(dá)，但是對(duì)于轉(zhuǎn)基因羊草對(duì)周圍生態(tài)環(huán)境的影響還未見相關(guān)報(bào)道，篩選突變體是羊草愈傷組織的另一用途，陳暉等用組織培養(yǎng)方法篩選獲得羊草抗羥脯氨酸(HYP)變異系HR20-8，該變異系細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸和蛋白質(zhì)組分氨基酸含量均發(fā)生了較大的變化，與供體對(duì)照比較，分別提高2.35倍和1.40倍，其中，游離脯氨酸和蛋白質(zhì)組分脯氨酸分別提高6.6倍和3.0倍，且脯氨酸合成途徑必需的r-谷氨酸激酶的活性提高了2.5倍。

3 羊草酶蛋白類研究

蛋白質(zhì)是生物體生命中的第一重要物質(zhì)，是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，同時(shí)能夠調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，植物對(duì)抗非生物脅迫必然有蛋白質(zhì)的參與，比如耐冷蛋白、熱休克蛋白、水通道蛋白、赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)蛋白等，從羊草中檢測(cè)這些蛋白的含量以及克隆表達(dá)該蛋白的基因?qū)τ谘芯垦虿菽湍娣肿訖C(jī)理和改善羊草品質(zhì)都具有重要意義。

目前對(duì)于羊草酶蛋白的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，主要有細(xì)胞色素氧化酶、過氧化物酶、脂酶同工酶等，其應(yīng)用也僅局限于闡明羊草的遺傳分化，通過聚類分析可以研究羊草種群在不同地理及生態(tài)環(huán)境中羊草在分子水平上細(xì)胞色素氧化酶同工酶存在著種內(nèi)分化，羊草在同工酶水平上的分化受多個(gè)環(huán)境因子的綜合影響，而且與羊草耐寒性能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，張麗萍等對(duì)采自同一天然草地上葉片呈黃綠色、灰綠色兩種類型羊草的根、莖、葉的過氧化物同工酶、脂酶同工酶進(jìn)行了分析比較，結(jié)果表明，兩種葉色羊草，其相同組織的過氧化物同工酶譜及脂酶同工酶譜基本一致，兩種羊草葉片呈現(xiàn)不同顏色只屬不同生態(tài)型，

磁場(chǎng)處理不僅可以促進(jìn)羊草的生長(zhǎng)。而且還能提高羊草的抗鹽堿性，磁場(chǎng)使羊草過氧化物酶(POD)活性提高，并且誘發(fā)了一條新的同工酶帶，張衛(wèi)東等認(rèn)為羊草自交不孕的原因是自交不親和。并利用禾本科植物自交不親和性有關(guān)的硫氧還蛋白(thsioredoxin)^基因設(shè)計(jì)的引物在羊草DNA中檢測(cè)到預(yù)期片段，說明硫氧還蛋白h基因可能與羊草的自交不親和性有關(guān)，該基因現(xiàn)已被克隆并能夠從GenBank中查到其序列。

研究羊草草原土壤酶的活性可以判斷土壤的肥力，土壤肥力水平接近則土壤酶的活性相似，土壤蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶的活性與土壤有機(jī)碳、全氮呈顯著相關(guān)關(guān)系，可以反映土壤肥力水平高低，是評(píng)價(jià)土壤退化的重要指標(biāo)。

4 羊草耐逆基因的分離與克隆

羊草具有耐寒、耐旱、耐鹽堿的特性，并且蛋白質(zhì)含量較高，說明羊草在面對(duì)非生物脅迫時(shí)高效表達(dá)能夠適應(yīng)、緩解或?qū)瓜鄳?yīng)逆境條件的物質(zhì)，尤其是調(diào)控這些物質(zhì)表達(dá)的酶類基因，據(jù)報(bào)道，羊草種子個(gè)體萌發(fā)期最大忍受pH范圍是9.14-9.53，對(duì)于NaCl可耐受的最大強(qiáng)度為600mmol/L，對(duì)于Na2C03可耐受的最大強(qiáng)度為175mmol/L，為了弄清這種適應(yīng)機(jī)制的復(fù)雜性，通過大規(guī)模的cDNA克隆或者表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的測(cè)序分離相關(guān)基因是非常重要的，Jin等采集自然生長(zhǎng)的植物葉組織經(jīng)過Na2CO3脅迫處理構(gòu)建了cDNA文庫，并對(duì)其EST進(jìn)行測(cè)序?qū)Ρ确治?，推斷在羊草葉和根中各有39和31個(gè)非生物脅迫相關(guān)基因，這些EST資源將有助于對(duì)植物耐鹽堿分子基礎(chǔ)的深入研究和理解。

甜菜堿是在生物體內(nèi)起著滲透保護(hù)作用最主要的細(xì)胞相溶性物質(zhì)，編碼決定該物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶一甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因已經(jīng)先后從多種生物體內(nèi)得到克隆，并在多種植物中進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。已獲得了抗鹽、抗寒、耐旱能力得到較大程度提高的轉(zhuǎn)基因植株，某些植物體內(nèi)的甜菜堿含量和BADH活性隨著土壤鹽堿化程度的加重而增加，因此推測(cè)甜菜堿可能與羊草耐鹽堿性有關(guān)，目前羊草中的部分BADH基因片段也已經(jīng)被成功克隆。

5　問題與展望

第2篇：分子生物學(xué)研究范文

Abstract: The animal protects own one driving way to ambient temperature's adaptation, displays in the duplication and the expression pattern change of the cell and presents the new gene open and the new protein factor synthesis. The gene level, the protein level, the cell membrane level and so on three aspects has carried on the summary about the research survey of animal which adapts to the ambient temperature, and discussed the molecular biology mechanism as well as in evolution significance which animal adapts to the ambient temperature.

關(guān)鍵詞： 動(dòng)物；溫度；基因；蛋白質(zhì)；細(xì)胞膜

Key words: animal；temperature；gene；protein；cell membrane

中圖分類號(hào)：Q291文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-4311（2011）25-0324-02

0 引言

動(dòng)物的一切生命活動(dòng)（生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖等）都是在一定的環(huán)境溫度中進(jìn)行的。一般說來，變溫動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育所要求的溫度條件在 6-36℃范圍內(nèi)；恒溫動(dòng)物由于自身有調(diào)節(jié)體溫的能力，對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)范圍廣些[1]。當(dāng)環(huán)境溫度在最低和最適溫度之間時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)的生理生化反應(yīng)會(huì)隨著溫度的升高而加快，代謝活動(dòng)加強(qiáng)，從而加快生長(zhǎng)發(fā)育速度；當(dāng)溫度高于最適溫度后，參與生理生化反應(yīng)的酶系統(tǒng)受到影響，代謝活動(dòng)受阻，勢(shì)必影響到動(dòng)物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。環(huán)境溫度若超出動(dòng)物所要求的范圍，動(dòng)物的生命活動(dòng)就會(huì)出現(xiàn)停滯；溫度過高或過低會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體死亡[2]。近年來關(guān)于動(dòng)物對(duì)外界環(huán)境溫度適應(yīng)的分子生物學(xué)研究主要集中在基因水平、蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞膜水平三個(gè)方面。

1 基因水平上的溫度

動(dòng)物對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)，會(huì)使自身的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)模式發(fā)成變化，以適合環(huán)境的變化，此時(shí)它會(huì)出現(xiàn)新的基因開放和新蛋白因子的合成，這總的來說是動(dòng)物對(duì)自身的一種保護(hù)方式。

外界環(huán)境溫度的改變可以誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)熱激蛋白家族基因的大量表達(dá)，從而調(diào)整動(dòng)物有機(jī)體對(duì)外界環(huán)境溫度的適應(yīng)。

盡管熱激蛋白家族基因序列保守，編碼序列變異較低，但是，由于目前動(dòng)物種類逐漸增多，熱激蛋白基因序列和拷貝數(shù)等也在逐步顯示出不同的趨勢(shì)。

適應(yīng)不同溫度的果蠅居群，其熱激蛋白70基因內(nèi)存在兩個(gè)顯著的差異[4]，一個(gè)大的插入/缺失（indel）多態(tài)位點(diǎn)（56H8/122）和一個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)差異；對(duì)于來自澳大利亞東部不同緯度的11個(gè)居群，插入/缺失位點(diǎn)的頻率與緯度呈正相關(guān)，由于緯度與溫度最大（小）值和平均值呈負(fù)相關(guān)，提示溫度和熱值變化可能對(duì)Hsp70基因的這一變異頻率產(chǎn)生了影響，Anderson[5]等也發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅3號(hào)染色體右臂上hsr-omega基因的8bp缺失作為一個(gè)遺傳標(biāo)記與緯度及最高溫（最熱月）呈正相關(guān)，另一個(gè)3端重復(fù)的標(biāo)記則多出現(xiàn)于溫帶群體中，與冷適應(yīng)性相關(guān)。適應(yīng)于較低緯度的Drosophila lummei有7個(gè)Hsp70基因拷貝，其熱脅迫抗性高于具有5個(gè)拷貝的Drosophila lummei，后者在分布上處于較高的緯度，提示Hsp70基因結(jié)構(gòu)與果蠅的適應(yīng)緯度有相關(guān)性[6]。

果蠅體內(nèi)一個(gè)名為“DmDG”的基因活性一旦下降，果蠅就會(huì)“怕熱”，從而喜歡向溫度更低的地方轉(zhuǎn)移，其喜好的環(huán)境溫度要比正常情況下低5攝氏度[7]?！癉mDG”基因可能與果蠅的代謝功能相關(guān)。這個(gè)基因活性下降后，果蠅體內(nèi)能量代謝就會(huì)活躍，于是就會(huì)更喜歡低溫環(huán)境。動(dòng)物體內(nèi)利用基因調(diào)節(jié)溫度適應(yīng)性的機(jī)制普遍存在，這可以使動(dòng)物適應(yīng)很大的溫度變化。

克隆斑潛蠅（Liriomyza sativae）3種小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8和Hsp21.7）和2種Hsp60（TCP1α，TCP1ζ），定量PCR分析表明，3種小分子Hsp均能被低溫所誘導(dǎo)表達(dá)，而且Hsp20.8對(duì)低溫更敏感，這意味著不同的小分子Hsp可能響應(yīng)不同強(qiáng)度的低溫脅迫。6種Hsp基因（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7、TCP1α、TCP1ζ和Hsp90）的相對(duì)表達(dá)量在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段差異顯著?？偟谋磉_(dá)趨勢(shì)是：小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7）在蛹期表達(dá)量最高，而大分子Hsp（TCP1α、TCP1ζ、Hsp90）的表達(dá)量則隨著生長(zhǎng)發(fā)育而遞增[8]。這意味著除響應(yīng)溫度脅迫外，熱激蛋白基因可能還在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中起著一定的作用。

2 蛋白質(zhì)水平上的溫度適應(yīng)

熱激蛋白（Hsps）是生物適應(yīng)環(huán)境溫度變化的一個(gè)重要媒介分子。受到熱脅迫刺激后，動(dòng)物有機(jī)體對(duì)熱的脅迫抗性提高與熱激蛋白表達(dá)量普遍成正相關(guān)[9]。

熱激蛋白存在于所有動(dòng)物細(xì)胞中，是動(dòng)物受到應(yīng)激原刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白，與機(jī)體的應(yīng)激關(guān)系密切，在進(jìn)化上高度保守。對(duì)滯育的吉普賽蛾（Lymantria dispar）幼蟲給以37-41℃的熱激可以誘發(fā)合成7種Hsps（分子量分別為90，75，73，60，42，29和22ku），-10--20℃的冷休克導(dǎo)致其產(chǎn)生2種Hsps（90和75ku），當(dāng)在25℃下恢復(fù)時(shí)另外又合成分子量29ku的熱激蛋白[10]。斑馬魚在熱脅迫（28-37℃）和冷脅迫（20-28℃）下的熱激蛋白表達(dá)模式存在差異，在熱脅迫條件下，Hsp70呈上調(diào)表達(dá)，而冷脅迫下Hsp70則顯穩(wěn)定表達(dá)[11]。將新月魚的成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)溫度從28℃調(diào)節(jié)到37℃時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生3種不同的熱休克蛋白[12]。

較緩和的高溫對(duì)B型煙粉虱Hsp70表達(dá)具有誘導(dǎo)作用，極端高溫會(huì)抑制Hsp70表達(dá)。在37-41℃范圍內(nèi)，Hsp70的表達(dá)量隨著溫度的升高而升高，在41℃時(shí)達(dá)到最高峰；當(dāng)溫度升高到43℃和45℃，B型煙粉虱Hsp70的表達(dá)量迅速降低。B型煙粉虱溫室種群體內(nèi)的Hsp70表達(dá)量與溫室內(nèi)的溫度有關(guān)：上午到中午隨著氣溫的升高，B型煙粉虱體內(nèi)Hsp70表達(dá)量隨之上升；傍晚氣溫降低時(shí)，Hsp70表達(dá)量也隨之下降[13]。Kimura（1998）比較過3個(gè)果蠅近緣種熱休克蛋白基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在冷激條件下，亞熱帶低海拔種（Drosophila watanabe）誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)的閾溫度要比溫帶種（D．traurara）和亞熱帶高海拔種（D．trapezifrons）高，而亞熱帶低海拔種的耐寒性卻最低，說明在果蠅中熱休克蛋白基因表達(dá)和耐寒性呈負(fù)相關(guān)[14]。Sorensen et al（2001）研究果蠅（D．huzzatii）不同自然種群間HSP70基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)在冷激下寒溫帶種群誘導(dǎo)熱休克蛋白基因表達(dá)的閾溫度要明顯低于熱帶種群[15]。

3 細(xì)胞膜水平上的溫度適應(yīng)

在正常生理溫度下，細(xì)胞膜的主動(dòng)運(yùn)輸、酶的活性、胞外分泌等機(jī)能才能正常進(jìn)行[16]。細(xì)胞的膜脂在不同溫度下具有不同的?；満玩滈L(zhǎng)度[16]。細(xì)胞膜化學(xué)成分改變可能是對(duì)溫度適應(yīng)的最普遍模式[16]。低溫通過影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性而影響細(xì)胞正常的機(jī)能，對(duì)低溫的適應(yīng)不可避免地會(huì)涉及到細(xì)胞膜化學(xué)成分的改變。膽固醇能夠促使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的有序化，從而增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性。魚類通過改變脂肪酸中不飽和成分含量和極性磷脂頭部組分，減少細(xì)胞膜中甾醇/磷脂比率來改變膜的流動(dòng)性使魚類更加適應(yīng)寒冷的外界環(huán)境[17]。通過對(duì)不同溫度適應(yīng)下虹鱒魚（rainbow trout）的肝、腎、腮等組織細(xì)胞細(xì)胞膜中膽固醇（C）與磷脂（P）含量的研究發(fā)現(xiàn)，5℃適應(yīng)組細(xì)胞膜的C/P 值顯著低于20℃適應(yīng)組[3]。把魚體暴露于低溫下會(huì)導(dǎo)致的極性磷脂中非飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例增高，有利于在低溫下維持細(xì)胞膜流動(dòng)性，使魚體更能抵抗低溫?fù)p害[18]。低溫還誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪酸氧化酶的生成，由于它可以提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量，從而提高了細(xì)胞膜在低溫條件下的流動(dòng)性[19]。

在動(dòng)物對(duì)溫度的適應(yīng)過程中，動(dòng)物細(xì)胞還通過膜上各種離子通道數(shù)量及分布的改變使細(xì)胞內(nèi)離子的成分和濃度發(fā)生相應(yīng)的改變。研究表明，在北極生活的兩種魚類：Trematomus bernacchii和Trematomus newnesi在適應(yīng)較高溫度過程中，腮和腎等滲透壓調(diào)節(jié)器官細(xì)胞膜上的Na/K+-ATP酶活性升高，將細(xì)胞內(nèi)鈉的、氯離子快速泵出體外，從而使得血清中滲透壓明顯降低，與海水間的滲透壓差增大。研究結(jié)果表明，在冷環(huán)境中，魚類靠升高體液離子濃度及滲透壓來縮小與外界海水之間的差異，從而減少能量損耗[3]。鴨子對(duì)冷適應(yīng)表現(xiàn)為肌漿網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+-ATPase活性及Ca2+釋放通道數(shù)量上的改變時(shí)相與非寒顫產(chǎn)熱的發(fā)生相一致[20]。

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第3篇：分子生物學(xué)研究范文

關(guān)鍵詞：鉀離子通道；結(jié)構(gòu)；基因

離子通道(ion channe1)是跨膜蛋白，每個(gè)蛋白分子能以高達(dá)l08個(gè)／秒的速度進(jìn)行離子的被動(dòng)跨膜運(yùn)輸，離子在跨膜電化學(xué)勢(shì)梯度的作用下進(jìn)行的運(yùn)輸，不需要加入任何的自由能。一般來講，離子通道具有兩個(gè)顯著特征：

一是離子通道是門控的，即離子通道的活性由通道開或關(guān)兩種構(gòu)象所調(diào)節(jié)，并通過開關(guān)應(yīng)答相應(yīng)的信號(hào)。根據(jù)門控機(jī)制，離子通道可分為電壓門控、配體門控、壓力激活離子通道。

二是通道對(duì)離子的選擇性，離子通道對(duì)被轉(zhuǎn)運(yùn)離子的大小與電荷都有高度的選擇性。根據(jù)通道可通過的不同離子，可將離子通道分為鉀離子(potassium ion，k )通道、鈉離子(natrium ion，na )通道、鈣離子(calcium ion，ca2 )通道等。其中，k 通道是種類最多、家族最為多樣化的離子通道，根據(jù)其對(duì)電勢(shì)依賴性及離子流方向的不同，可把k 通道分為兩類：①內(nèi)向整流型k 通道(inward rectifier k channel；kin)，② 外向整流型k 通道(outward rectifier khannel；k out)。k 是植物細(xì)胞中含量最為豐富的陽離子，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的唯一的一價(jià)陽離子，它在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的作用，具有重要的生理功能。植物中可能存在k 通道，這一點(diǎn)早在20世紀(jì)6o年代植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)界就有人提出，而一直到80年代才被schroeder等人[23證實(shí)，他們利用膜片鉗(patch chmp)技術(shù)，首先在蠶豆(v／c／afaba)的保衛(wèi)細(xì)胞中檢測(cè)出了k 通道鉀離子通道的結(jié)構(gòu)單個(gè)鉀離子通道是同源四聚體，4個(gè)亞基(subunit)對(duì)稱的圍成一個(gè)傳導(dǎo)離子的中央孔道(pore)，恰好讓單個(gè)k 通過。對(duì)于不同的家族，4"亞基有不同數(shù)目的跨膜鏈(membrane。span。ning element)組成。兩個(gè)跨膜鏈與它們之間的p回環(huán)(pore helix loop)是k 通道結(jié)構(gòu)的標(biāo)志2tm／p)，不同家族的k 通道都有這樣一個(gè)結(jié)目前從植物體中發(fā)現(xiàn)的k 通道幾乎全是電壓門控型的，如保衛(wèi)細(xì)胞中的k 外向整流通道等，其結(jié)構(gòu)模型如圖2一a所示。離子通透過程中離子的選擇性主要發(fā)生在狹窄的選擇性過濾器(selectivity filter)中(圖2一b)，x射線晶體學(xué)顯示選擇性過濾器長(zhǎng)1．2 nill，孔徑約nill，k鉀離子通道的作用.有關(guān)k 通道在植物體內(nèi)的作用研究并不多。

從目前的結(jié)果來看，認(rèn)為主要是與k 吸收和細(xì)胞中的信號(hào)傳遞(尤其是保衛(wèi)細(xì)胞)有關(guān)。小麥根細(xì)胞中過極化激活的選擇性內(nèi)流k 通道的表觀平衡常數(shù)km值為8．8 mmol／l，與通常的低親和吸收系統(tǒng)km值相似[ 。近年來，大量k 通道基因的研究表明，k 通道是植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子的重要途徑之一。保衛(wèi)細(xì)胞中氣孔的開閉與其液泡中的k 濃度有密切關(guān)系。質(zhì)膜去極化激活的k 外向整流通道引起k 外流，胞質(zhì)膨壓降低，導(dǎo)致氣孔的關(guān)閉。相反，質(zhì)膜上h．a(chǎn)tpase激活的超極化(hyperpolarization)促使內(nèi)向整流鉀離子通道(k in)的打開，引起k 的內(nèi)流，最終導(dǎo)致氣孔的張開鉀離子通道相關(guān)基因及其功能特征迄今，已從多種植物或同種植物的不同組織器官中分離得到多種k 通道基因(圖3)，根據(jù)對(duì)其結(jié)構(gòu)功能和dna序列的分析，可以把它們分為5個(gè)大組：工，ⅱ，ⅳ組基因?qū)儆趦?nèi)向整流型通道；m組屬于弱內(nèi)向整流型通道(weakly inwardakt1arabidopsis k transporter 1)是第一個(gè)克隆到的植物k 通道基因，采用酵母雙突變體互補(bǔ)法從擬南芥cdna文庫中篩選出來cdna序列分析表明，akt1長(zhǎng)2 649 bp，其中的閱讀框?yàn)? 517 bp，編碼838個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約為95 400 da。akt1編碼的k 通道，對(duì)k 有極高的選擇性，其選擇性依次是k >rb >>na >li 。

northern blot分析表明，akt1組織特異性較強(qiáng)，主要在根組織中表達(dá)zmk1(zea mays k channel 1)是從玉米胚芽鞘中分離出的k 通道基因，在皮層表達(dá)。在卵母細(xì)胞中的表達(dá)表明，zmk1編碼的k 通道是通過外部酸化激活的。有研究表明，藍(lán)光對(duì)zmk1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影響[3 2l。1組kat1組基因編碼內(nèi)向整流鉀離子通道，其與akt1組基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上的最大區(qū)別是在cooh端沒有錨蛋白相關(guān)區(qū)(枷n—related do—main，anky)。kat1組基因主要包括kat1，kst1，sirk，kzm1，kpt1等。kat1(arabidopsis inward rectifier k channel1)是與akt1同時(shí)從擬南芥cdna文庫中篩選出來的植物k 通道基因。kat1基因的閱讀框含有2 031個(gè)核苷酸，編碼的多肽由677個(gè)氨基酸殘基組成，相分子質(zhì)量約為78 000 da。kat1的表達(dá)具有組織特異性，kat1在擬南芥植株中的主要表達(dá)部位是保衛(wèi)細(xì)胞，在根和莖中也有少量的表達(dá)。人們認(rèn)為kat1通道可能參與了氣孔開放，并向維管組織中轉(zhuǎn)運(yùn)k ，而不是直接從土壤中吸收kj。

以kat1為探針，又能從擬南芥cdna文庫中篩選出kat2等功能類似的內(nèi)向整流型k 通道基因通過基因工程技術(shù)，人們已相繼開展了將kati和akti基因?qū)说綌M南芥、煙草和水稻的研究，并獲得了一些轉(zhuǎn)基因植株。比如，施衛(wèi)明等利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已成功地把kat1和akt1導(dǎo)人擬南芥和野生型煙草中，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株及其純合株系，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的吸鉀速率和對(duì)k 的累積能力都比對(duì)照的有明顯的提高，而且，經(jīng)過分子檢測(cè)，也證實(shí)711和akt1基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到了整合和表達(dá)。因此，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段和基因工程技術(shù)篩選高效利用鉀的作物品種或利用現(xiàn)有的鉀離子通道基因改良作物品種，從而提高作物本身的鉀吸收利用能力應(yīng)該是目前主要的研究方向。可以相信，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、基因工程技術(shù)和有關(guān)分析測(cè)試技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。隨著研究工作的不斷深入，有關(guān)鉀離子通道基因的分離、克隆和利用會(huì)取得更大的進(jìn)展。

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第4篇：分子生物學(xué)研究范文

關(guān)鍵詞:研究生培養(yǎng);分子生物學(xué);實(shí)驗(yàn)教學(xué)

分子生物學(xué)是從分子水平上研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的科學(xué),是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并與其他學(xué)科交叉滲透最廣泛的前沿學(xué)科之一.進(jìn)入21世紀(jì),分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法已經(jīng)應(yīng)用到了生物學(xué)各個(gè)分支學(xué)科的研究中[1].研究生教育是培養(yǎng)具有科學(xué)精神和創(chuàng)新能力高層次人才的主要方式,培養(yǎng)碩士研究生創(chuàng)新思維和科學(xué)研究能力,將是作為研究生階段的研究工作和將來作為科研人員所必備的素質(zhì).近年來,很多高校在研究生的培養(yǎng)上采取了重大舉措,如浙江大學(xué)、中國(guó)科技大學(xué)、西安交通大學(xué)、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)等,實(shí)現(xiàn)了研究生的理論教學(xué)、實(shí)驗(yàn)教學(xué)和學(xué)位論文研究三階段的培養(yǎng)模式[2].在加強(qiáng)研究生理論教學(xué)和學(xué)位論文研究的同時(shí),注重研究生實(shí)踐能力的培養(yǎng),增加了實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié),實(shí)現(xiàn)研究生實(shí)踐能力的寬領(lǐng)域培養(yǎng),再通過學(xué)位論文的研究,形成研究生實(shí)踐能力的立體全方位培養(yǎng).作為一個(gè)生物學(xué)研究生,把本科所學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)與科學(xué)研究的最新進(jìn)展聯(lián)系起來,學(xué)好、學(xué)通分子生物學(xué)是必需的一步.基于此,2012年起我校在生物學(xué)科研究生學(xué)位課中設(shè)置“分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”課,3年來雖然取得了明顯的成效,得到了研究生與指導(dǎo)教師的認(rèn)可,但在實(shí)際運(yùn)行過程中也發(fā)現(xiàn)了一些問題,還需要通過不斷的改革和實(shí)踐,使生物學(xué)科的研究生更系統(tǒng)、更全面地掌握分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和技能,為后續(xù)的研究性實(shí)驗(yàn)工作和今后走上工作崗位提高科研水平打好一個(gè)堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

1課程定位及理念

分子生物學(xué)在20世紀(jì)取得了理論和技術(shù)的飛速發(fā)展.分子生物學(xué)技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域當(dāng)中.隨著越來越多的理論突破,分子生物學(xué)技術(shù)也日新月異.在高等院校的生物相關(guān)學(xué)科的研究生教學(xué)中,越來越廣泛地注重分子生物學(xué)的教學(xué).分子生物學(xué)理論課教學(xué)內(nèi)容多,范圍廣,有一定深度,學(xué)生很難透徹理解和掌握,如果不做實(shí)驗(yàn),只學(xué)習(xí)理論,往往會(huì)事倍功半,理不出頭緒.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課能給學(xué)生親自動(dòng)手參與實(shí)驗(yàn)全過程的機(jī)會(huì),便于學(xué)生加深對(duì)相關(guān)理論的理解[3].研究生來自不同的院校,由于各院校課程設(shè)置不同,研究生接受的本科階段的教育差別很大,這種差別在實(shí)驗(yàn)操作能力上體現(xiàn)最為明顯.對(duì)于已經(jīng)進(jìn)入分子時(shí)代的生命科學(xué)來說,不熟練分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的學(xué)生就很難快速適應(yīng)課題研究的科研工作.在研究生學(xué)位課中設(shè)置分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課,合理安排實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容,建立常規(guī)操作與科研課題相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)課程體系,是提升研究生實(shí)踐能力的重要途徑,同時(shí)也能為學(xué)生完成碩士學(xué)位論文及將來從事科研工作打下良好基礎(chǔ).內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物學(xué)碩士研究生學(xué)位點(diǎn)于2006年經(jīng)批準(zhǔn)設(shè)立,2007年起招收首批碩士研究生,近10年來,已為及全國(guó)輸送了一批從事生物學(xué)研究與開發(fā)的優(yōu)秀人才.“加強(qiáng)專業(yè)技術(shù)教學(xué)、緊跟學(xué)科發(fā)展前沿、全面提升研究生培養(yǎng)質(zhì)量”一直是本學(xué)科研究生培養(yǎng)工作的重點(diǎn)和目標(biāo).為適應(yīng)新形勢(shì)下高等院校研究生教育與創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的目標(biāo),對(duì)研究生分子生物學(xué)教學(xué)的改革勢(shì)在必行.2012年以來,我們通過在研究生學(xué)位課中設(shè)置“分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”課,不僅顯著地提高了研究生對(duì)分子生物學(xué)課程的學(xué)習(xí)熱情,而且明顯提升了研究生的科研能力.

2課程建設(shè)及特色

2．1課程建設(shè)的過程與方法

每學(xué)年的秋學(xué)期初新錄取的研究生入學(xué),根據(jù)對(duì)新生分子生物學(xué)知識(shí)背景和實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力的詳細(xì)調(diào)研合理安排實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容,建立常規(guī)操作與科研課題相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)課程體系,并根據(jù)學(xué)科發(fā)展不斷更新和完善,力求促進(jìn)研究生科研工作的順利開展.研究生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革分為3個(gè)階段進(jìn)行.

2．1．1準(zhǔn)備階段

組織相關(guān)人員成立課題小組,對(duì)小組人員進(jìn)行具體分工,以2015年新入學(xué)的碩士研究生為研究對(duì)象,采用問卷調(diào)查方式對(duì)他們的分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)與實(shí)驗(yàn)操作能力進(jìn)行摸底,撰寫調(diào)查報(bào)告[4].

2．1．2實(shí)施階段

(1)制定教學(xué)大綱.根據(jù)準(zhǔn)備階段的調(diào)查結(jié)果討論研究生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)大綱,實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)行多層次、模塊化管理,分為基礎(chǔ)性、綜合設(shè)計(jì)性、創(chuàng)新性3個(gè)模塊.基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目以基本的分子生物學(xué)操作技術(shù)為主,如:質(zhì)粒DNA的提取、限制性內(nèi)切酶酶切DNA分子、瓊脂糖凝膠電泳分離DN段、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、重組DNA分子的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化等、PCR擴(kuò)增目的基因等.對(duì)沒有任何分子生物學(xué)常規(guī)操作基礎(chǔ)的研究生要逐個(gè)開出;對(duì)本科階段已經(jīng)接觸并熟悉這些基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)的研究生可直接開出綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn),如:多種方法獲得目的基因、動(dòng)植物中某關(guān)鍵基因的克隆、重組質(zhì)粒的構(gòu)建等.創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目全部由本學(xué)科教師承擔(dān)的科研課題轉(zhuǎn)化而來,研究生可根據(jù)自己的研究方向與興趣愛好選擇項(xiàng)目完成,包括植物細(xì)胞中MYB類轉(zhuǎn)錄因子的篩選、與人類遺傳病相關(guān)的核苷酸重復(fù)序列的克隆等.

(2)學(xué)生選課.將全部實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容及具體開出安排提前公布,學(xué)生根據(jù)實(shí)際情況與自己的研究方向進(jìn)行實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的選擇,這一環(huán)節(jié)須由指導(dǎo)教師協(xié)助完成.選課結(jié)束后根據(jù)每個(gè)項(xiàng)目的選課情況準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn),包括學(xué)生分組、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備、耗材試劑和實(shí)驗(yàn)講義與實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊(cè)分發(fā)等.

(3)預(yù)實(shí)驗(yàn).指導(dǎo)教師根據(jù)學(xué)生分組情況,每組安排組長(zhǎng)一名,副組長(zhǎng)一名,在實(shí)驗(yàn)開出前協(xié)助指導(dǎo)教師完成預(yù)實(shí)驗(yàn).

(4)實(shí)驗(yàn)課開出.按計(jì)劃認(rèn)真組織研究生開出實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)操作階段,要求學(xué)生熟練掌握實(shí)驗(yàn)操作流程,嚴(yán)格按規(guī)范進(jìn)行操作.同時(shí)指導(dǎo)教師要充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性和主動(dòng)性,增強(qiáng)學(xué)生獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)的能力和實(shí)際動(dòng)手能力,使學(xué)生能夠盡可能主動(dòng)地、獨(dú)立地完成實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程,為以后獨(dú)立從事科研設(shè)計(jì)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ).

(5)課程考核.實(shí)驗(yàn)課結(jié)束后進(jìn)行成績(jī)考核,綜合學(xué)生的預(yù)習(xí)報(bào)告、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫情況給出實(shí)驗(yàn)課成績(jī).

(6)編寫研究生實(shí)驗(yàn)教材.基于教學(xué)實(shí)踐的積累,編寫研究生實(shí)驗(yàn)教材“研究生現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”,重點(diǎn)面向研究生的實(shí)驗(yàn)教學(xué),將分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)和近年來發(fā)展起來的新技術(shù)、新方法有機(jī)融合.

2．1．3總結(jié)階段

跟蹤調(diào)查,了解研究生在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課結(jié)束進(jìn)入課題研究后的情況,掌握他們?cè)诜肿硬僮鞲鱾€(gè)環(huán)節(jié)上的操作熟練程度,對(duì)取得的研究資料做全面的整理分析.在學(xué)科內(nèi)部推出“研究生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”示范課,并完成相應(yīng)的資料庫與光盤制作,并進(jìn)一步在全校范圍內(nèi)推廣.同時(shí)課程改革小組的成員要不斷討論項(xiàng)目實(shí)施過程中存在的問題,并及時(shí)與兄弟院校溝通學(xué)習(xí),提出切實(shí)可行的辦法[5].

2．2指導(dǎo)教師隊(duì)伍建設(shè)

自2012年生物學(xué)科碩士研究生開設(shè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課以來,該課程的教學(xué)任務(wù)一直由我校外聘的留美分子生物學(xué)專家王建英教授負(fù)責(zé),另配2名講師作為助手.經(jīng)過3年來的教學(xué)實(shí)踐體會(huì),加上學(xué)生與研究生導(dǎo)師的意見反饋,我們發(fā)現(xiàn)這種單一的指導(dǎo)教師模式是需要改進(jìn)的,需要建設(shè)一支由長(zhǎng)期工作在科研、教學(xué)一線教師組成的研究生實(shí)驗(yàn)課教學(xué)團(tuán)隊(duì).教學(xué)任務(wù)分配上,根據(jù)團(tuán)隊(duì)內(nèi)每位教師主要從事的科研領(lǐng)域和專業(yè)特長(zhǎng),分配相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容,每個(gè)項(xiàng)目安排2名指導(dǎo)教師,他們不僅熟悉所指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn),及時(shí)解決實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的各種問題,還能將本領(lǐng)域相關(guān)的科研前沿、熱點(diǎn)問題介紹給學(xué)生,以開闊學(xué)生視野,使每次實(shí)驗(yàn)均能獲得預(yù)期結(jié)果.同時(shí),指導(dǎo)教師在教學(xué)實(shí)踐過程中也不斷發(fā)現(xiàn)和審視自己,包括對(duì)自身專業(yè)知識(shí)的把握與實(shí)驗(yàn)技能熟練程度的反思,這樣也能促使他們緊密跟蹤學(xué)科發(fā)展前沿不斷提高[6].本課程經(jīng)各方面協(xié)調(diào)討論,現(xiàn)已逐漸組建了一支人員穩(wěn)定、業(yè)務(wù)基礎(chǔ)全面、具有團(tuán)結(jié)協(xié)作精神的教學(xué)團(tuán)隊(duì).其中教授3人、副教授2人、講師2人.其中大多數(shù)教師承擔(dān)國(guó)家自然科學(xué)基金、內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金、內(nèi)蒙古高校基金等科研項(xiàng)目,在努力完成這些科研任務(wù)的同時(shí),有意識(shí)地將許多科研工作中的思路和先進(jìn)的技術(shù)轉(zhuǎn)化到研究生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)實(shí)踐中.實(shí)驗(yàn)課教學(xué)團(tuán)隊(duì)的建設(shè)極大地提高了研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量,并申請(qǐng)得到了我校研究生教學(xué)改革項(xiàng)目建設(shè)立項(xiàng)資助.

2．3實(shí)驗(yàn)課成績(jī)考核與結(jié)果評(píng)價(jià)

經(jīng)過教學(xué)團(tuán)隊(duì)的調(diào)研討論,針對(duì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)考核形式的問題,提出實(shí)驗(yàn)課評(píng)價(jià)體系多層次評(píng)價(jià)的管理制度,包含預(yù)習(xí)報(bào)告、平時(shí)考勤、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫情況5個(gè)部分,分別所占比例為1∶2∶4∶1∶2;針對(duì)設(shè)計(jì)性與創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn),要加上實(shí)驗(yàn)方案制定與實(shí)驗(yàn)論文撰寫環(huán)節(jié).針對(duì)研究生各實(shí)驗(yàn)組人數(shù)較少、時(shí)間較靈活、學(xué)生專業(yè)多樣化等特點(diǎn),在考核中更加注重實(shí)驗(yàn)的具體操作過程.在課程開課初要將考核方案告知學(xué)生,讓他們明確各環(huán)節(jié)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),在實(shí)際考核過程中如實(shí)記錄作為評(píng)價(jià)依據(jù).實(shí)驗(yàn)課結(jié)束后,通過“問卷調(diào)查與后期跟蹤相結(jié)合”的模式及時(shí)對(duì)教學(xué)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)[7].通過發(fā)放問卷調(diào)查表的方式綜合調(diào)查研究生對(duì)本門實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容設(shè)置、教學(xué)方法及授課教師的教學(xué)效果等信息的評(píng)價(jià).另外,在實(shí)驗(yàn)課結(jié)束一個(gè)學(xué)期后,我們對(duì)研究生指導(dǎo)教師進(jìn)行問卷調(diào)查,對(duì)上一年度的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果進(jìn)行了后期跟蹤評(píng)價(jià),對(duì)研究生進(jìn)入到各自實(shí)驗(yàn)室工作后的科研思維、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作能力等進(jìn)行調(diào)研,綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果[8].

3結(jié)語

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是生物學(xué)各分支學(xué)科科學(xué)研究必備的手段,在研究生入學(xué)后進(jìn)入課題研究之前開設(shè)“分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”課,熟練掌握基本的分子生物學(xué)操作技術(shù),這是生物學(xué)研究生快速進(jìn)入科研課題與順利完成碩士學(xué)業(yè)的基本保證[9].研究生經(jīng)過基本實(shí)驗(yàn)技能培訓(xùn)、全面綜合實(shí)驗(yàn)及自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的鍛煉及創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的全方位提升,科研能力得到大幅度提高.學(xué)生普遍反映研究生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)為他們順利進(jìn)行課題研究、完成學(xué)位論文和未來的科研工作奠定了良好基礎(chǔ),一部分學(xué)生在碩士期間就發(fā)表了高水平的SCI論文.為生物學(xué)研究生開設(shè)分子生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn),在內(nèi)蒙區(qū)內(nèi)外兄弟院校進(jìn)行此類設(shè)置的尚不多見,需要我們更加努力創(chuàng)立并逐步完善研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái),全面提升我校碩士研究生培養(yǎng)水平[10G12],及時(shí)將教師的科研成果提煉引入實(shí)驗(yàn)教學(xué),提高指導(dǎo)教師的教學(xué)能力,使實(shí)驗(yàn)內(nèi)容不斷更新,為研究生進(jìn)行課題研究及畢業(yè)以后從事相關(guān)的科研工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

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第5篇：分子生物學(xué)研究范文

病理性瘢痕包括增生性瘢痕(Hypertrophic Scar，HS)和瘢痕疙瘩(Keloid，K)，是因成纖維細(xì)胞增殖，生長(zhǎng)失控、膠原過度沉積導(dǎo)致真皮纖維化。K表現(xiàn)為侵襲性瘤樣生長(zhǎng)，而HS卻隨時(shí)間推移有自然軟化趨勢(shì)，可見在形成機(jī)制方面還有不同之處。雖然目前病理性瘢痕形成的機(jī)制還不太清楚，但這方面的研究卻方興未艾，本文就近年來對(duì)病理性瘢痕發(fā)生機(jī)制的研究綜述如下。

1　病理性瘢痕形成的機(jī)制研究

1．1　肌成纖維細(xì)胞在瘢痕形成中的作用：正常創(chuàng)面愈合過程中的創(chuàng)面收縮或過度愈合引起的病理性瘢痕以及各種纖維化疾病中，肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MFB)的作用越來越受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。MFB最主要的特征是胞質(zhì)中出現(xiàn)完整的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，包括微絲、微管系統(tǒng)。它除了表達(dá)胞漿肌動(dòng)蛋白外，還可以與以下四種主要表型共同表達(dá)：①波型蛋白(vimentin)；②波型蛋白和結(jié)合蛋白(desmin)；③波型蛋白和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)；④波型蛋白、結(jié)合蛋白和a-SMA。并且還證明MFB可以表達(dá)不同的平滑肌肌漿球蛋白重鏈(MHC)，表明MHC表型對(duì)進(jìn)一步鑒別分化好的MFB不同表型意義較大。而a-SMA是體內(nèi)MFB最常見的標(biāo)志，其次是波型蛋白，因此可用a-SMA鑒定MFB。

在增生性瘢痕及纖維化病灶中，a-SMA陽性的MFB持續(xù)存在。免疫組化顯示a-SMA陽性的MFB主要存在于HS結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)中，而K中則幾乎不存在MFB。因?yàn)轳：鄹泶竦奶匦詾閹缀醪晃s也不發(fā)生攣縮，內(nèi)含粗大的膠原纖維，而增生性瘢痕則會(huì)發(fā)生萎縮也易攣縮，內(nèi)含散亂的細(xì)膠原纖維，所以有理由認(rèn)為瘢痕的攣縮與其中所含的MFB有關(guān)。另外，在證實(shí)了胎羊、胎鼠等在胎內(nèi)前2／3的時(shí)間傷口不產(chǎn)生瘢痕，而到后1／3時(shí)間傷口會(huì)出現(xiàn)瘢痕愈合基礎(chǔ)上，Estes等通過透射電鏡及免疫組化方法研究了孕早期及孕晚期胎羊傷口MFB發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)孕75天制作的傷口中無a-SMA，而在100～120天制作的傷口中大量表達(dá)。電鏡下可見細(xì)胞中微絲逐漸增多、排列也漸規(guī)則，并發(fā)現(xiàn)伴有連接纖維形成，說明MFB在瘢痕形成過程中可能起到一定作用。

1．2　病理性瘢痕形成和細(xì)胞凋亡的關(guān)系：細(xì)胞凋亡為細(xì)胞的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺行為。在生理情況下，細(xì)胞凋亡起到調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量、便于形態(tài)發(fā)生、去除有害或異常細(xì)胞、清除已完成功能的細(xì)胞等作用；在病理情況下，凋亡不足或過度，均可導(dǎo)致疾病發(fā)生。最近有研究證實(shí)，人體的系統(tǒng)性硬化疾病中，存在成纖維細(xì)胞的凋亡增加及細(xì)胞外基質(zhì)的增加。通過電子顯微鏡與原位末端DN斷標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，肉芽組織向瘢痕組織轉(zhuǎn)變期間，隨著傷口的愈合，肌成纖維細(xì)胞和血管細(xì)胞的凋亡增加，并推測(cè)凋亡缺乏可能在病理性瘢痕的形成發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。通過TUNEL及免疫組經(jīng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕中存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，增生性瘢痕消退過程中，成纖維細(xì)胞數(shù)量的減少與成纖維細(xì)胞的增加相一致。由此可認(rèn)為，MFB凋亡不足和增加，是增生性瘢痕產(chǎn)生和消退的原因。Luo，F(xiàn)unayama等研究發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩組織中同時(shí)存在細(xì)胞增生、壞死和凋亡。Mcssadi等通過標(biāo)記定量研究發(fā)現(xiàn)，正常皮膚成纖維細(xì)胞凋亡率比瘢痕疙瘩高2倍，凋亡相關(guān)基因表達(dá)也下降。Chen等通過基因芯片對(duì)8400條人基因研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，普通瘢痕與瘢痕疙瘩相比，有402條基因的表達(dá)有區(qū)別，其中有250條基因上調(diào)，152條基因下調(diào)，有8種凋亡基因表達(dá)過低。由此推斷，瘢痕疙瘩不能正常凋亡并持續(xù)產(chǎn)生膠原，是其不斷增生的原因之一。

1．3　Bcl-2對(duì)病理性瘢痕的影響：病理性瘢痕均是以細(xì)胞增殖所致的疾病。Bcl-2是參與細(xì)胞增殖與凋亡的重要調(diào)節(jié)基因，對(duì)細(xì)胞凋亡具有直接抑制作用，并能促進(jìn)細(xì)胞的存活。我們的調(diào)查表明：Bcl-2可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，抑制成纖維細(xì)胞的凋亡。減少凋亡，延長(zhǎng)存活的作用，必然導(dǎo)致膠原蛋白合成沉積增多，從而促使皮膚纖維化發(fā)生。

1．4　氧自由基和病理性瘢痕的形成：氧自由基是體內(nèi)各種代謝反應(yīng)的中間產(chǎn)物，化學(xué)性質(zhì)活躍，很容易與其他分子或自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成新的自由基，由此引發(fā)連鎖反應(yīng)，它具有重要的生理功能，同時(shí)也與人體多種疾病密切相關(guān)。丙二醛(MDA)是自由基與生物膜中的多價(jià)不飽和脂肪酸作用發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成的終產(chǎn)物，它的產(chǎn)生與脂質(zhì)過氧化平行，測(cè)定其含量不僅可反映脂質(zhì)過氧化的程度，同時(shí)也間接反映了機(jī)體細(xì)胞損傷的程度。李偉人等通過測(cè)定病理性瘢痕中丙二醛的含量，發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕與瘢痕疙瘩中丙二醛含量均較正常人皮膚明顯升高(ρ＜0．05)，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩比較無差異(ρ＞0．05)，表明在病理性瘢痕中脂質(zhì)過氧化程度加重，局部組織細(xì)胞由于遭受自由基攻擊也可能發(fā)生了一定程度的損傷。而引起病理性瘢痕局部自由基產(chǎn)生和清除失衡的原因可能與生成增多有關(guān)。Wan等的研究也表明病理性瘢痕中與自由基生成有關(guān)的補(bǔ)體C3和游離鐵含量明顯高于正常皮膚。在成熟瘢痕中丙二醛含量與正常人皮膚比較無差異，則可能是因?yàn)樽杂苫膳c清除已恢復(fù)平衡，從而脂質(zhì)過氧化程度也趨于正常。同時(shí)我們也注意到，與成熟瘢痕相比增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中MDA含量非常顯著升高(ρ＜0．01)，提示通過減輕脂質(zhì)過氧化程度可能有助于防治病理性瘢痕的形成。

2　瘢痕疙瘩形成機(jī)制的研究

K是繼發(fā)于皮膚損傷，如創(chuàng)傷、燒傷或手術(shù)后，以膠原過度沉積為特征的皮膚疾病。其形成機(jī)制的研究，目前在細(xì)胞、分子生物學(xué)及遺傳學(xué)方面比較活躍。

2．1　抗瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的研究：K組織中成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)過度增生，大量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積和向正常皮膚侵襲、生長(zhǎng)從而形成K，其原因是瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(Keloid derived fibroblast，KFB)凋亡受阻引起的。Saed等在所有KFB的p53exon4編碼72位點(diǎn)，檢測(cè)到精氨酸脯氦酸的置換，而HS和K患者正常皮膚等標(biāo)本未發(fā)現(xiàn)異常，提示p53基因?yàn)镵FB后天獲得性突變的高發(fā)區(qū)，并且該基因精氨酸／精氨酸純合型患者耳部K的發(fā)生率明顯增加，而脯氨酸／脯氨酸純合型患者發(fā)生HS的幾率增加。卓陽等認(rèn)為，p53脯氨酸等位基因頻率的檢測(cè)，可作為K高危個(gè)體的判斷標(biāo)志。魯峰在20％(2／10)的K標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，fas exon9編碼區(qū)的“A”堿基的移碼突變，提示編碼fas“死亡區(qū)”結(jié)構(gòu)基因的突變，可導(dǎo)致fas蛋白功能喪失和K細(xì)胞凋亡障礙。Bel-2、c-jun和c-fos原癌基因與FB的增殖有關(guān)。在增生期，HS和K的基底細(xì)胞、散在的FB樣細(xì)胞和血管周圍紡錘形細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)Bcl-2，而c-jun和c-fos mRNA及其蛋白分子，則主要分布于真皮FB樣細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞，

正常皮膚未見上述異常表現(xiàn)，推測(cè)活躍的KFB增殖與Bcl-2蛋白和c-jun、c-fos轉(zhuǎn)錄和翻譯水平增加有關(guān)。1999年有研究發(fā)現(xiàn)，K組織中有64種凋亡誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)下降。K基因表達(dá)的重新編程或真皮模式的病態(tài)分化，可能涉及K的發(fā)病機(jī)制，可作為K的病理診斷標(biāo)志和治療策略。KFB凋亡普遍依賴caspase-9的活性作用。KFB凋亡相關(guān)基因表達(dá)的失衡，表面為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Vansforming growth factor TGF)β1活化以及p53、fas及caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)缺失，表明KFB凋亡抗性基因位點(diǎn)位于caspases上游。

在K形成的過程中，局部生長(zhǎng)因子非主要因素，起關(guān)鍵作用的是KFB對(duì)生長(zhǎng)因子的敏感性，即通過上調(diào)KFB胞膜上生長(zhǎng)因子受體的數(shù)量，提高外源性刺激信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力和效率，是其細(xì)胞增殖和凋亡抑制的主要原因之一。IGF和TGF-β1，通過促纖維化效應(yīng)和絲裂原效應(yīng)，刺激FB增殖和瘢痕形成，是與KFB凋亡抗性關(guān)系密切的細(xì)胞生長(zhǎng)因子。此外，腫瘤壞死因子-α在上調(diào)KFB抗凋亡能力中也發(fā)揮重要作用。

2．2　角質(zhì)形成細(xì)胞的異常作用：表皮-真皮相互作用是近年來創(chuàng)傷修復(fù)研究的熱點(diǎn)。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌作用，調(diào)節(jié)組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞增殖、分化和凋亡。在增生期K和HS表皮-真皮交界區(qū)域Bcl-2陽性，F(xiàn)B增多，提示表皮-真皮之間的相互作用，參與了病理性瘢痕的形成。KFB凋亡障礙可能與K低氧環(huán)境有關(guān)，即K微血管閉塞和缺血缺氧環(huán)境能誘導(dǎo)KFB和血管內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)Tβ1和缺氧誘導(dǎo)因子-1。后者可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，并可經(jīng)P13-激酶通路激活抗凋亡激酶(Akt／PKB)，以維持細(xì)胞的功能和低氧適應(yīng)性。

2．3　瘢痕疙瘩與langerhans細(xì)胞：K及HS組織中S-100蛋白及Cala免疫反應(yīng)陽性的Langerhans細(xì)胞明顯增多。Langerhans細(xì)胞與K形成關(guān)系密切。瘢痕過度增生的原因之一可能是由于病變部位Langerhans細(xì)胞增多，造成成纖維細(xì)胞過度合成膠原和細(xì)胞外基質(zhì)，最終結(jié)果造成了膠原的過量沉積。HS臨床表現(xiàn)類似于K，兩者表皮組織中的Langerhans細(xì)胞均明顯多于正常皮膚，且無明顯差異，說明兩者在形成機(jī)制方面存在某些相同處。

2．4　瘢痕疙瘩與染色體2q23、7P11及易感基因：最近，Mameros等通過瘢痕日本家系和非洲裔美國(guó)人家系進(jìn)行遺傳學(xué)研究后發(fā)現(xiàn)，日本家系與染色體2q23連鎖，非洲裔美國(guó)人家系與染色體7p11連鎖，他們還報(bào)道了一個(gè)有10人發(fā)病的非洲裔美國(guó)人中等大小的瘢痕疙瘩家系進(jìn)行同樣的研究，卻未發(fā)現(xiàn)與2q23和7p11存在連鎖關(guān)系，說明瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)存在異質(zhì)性。雖然單個(gè)基因的突變可以導(dǎo)致對(duì)瘢痕疙瘩產(chǎn)生特異的易感性，但是不同人群瘢痕疙瘩的發(fā)病率不同，而且發(fā)病年齡、臨床表型和對(duì)人不同治療的反應(yīng)，也存在差異，說明不僅是一對(duì)基因參與瘢痕疙瘩的發(fā)病。其發(fā)病機(jī)制可能是由于若干對(duì)微效基因(minor gene)。最近，張剛等采用比較基因組雜交方法檢測(cè)了6例瘢痕疙瘩患者的染色體后發(fā)現(xiàn)染色體1q、16q、20q和22q存在部分缺失，推測(cè)這種缺失導(dǎo)致抑制性基因的丟失，造成瘢痕疙瘩的發(fā)生和發(fā)展，從而認(rèn)為瘢痕疙瘩的發(fā)病可能與染色體的結(jié)構(gòu)畸變有關(guān)。

3　增生性瘢痕形成機(jī)制的研究

3．1　TGF-β3對(duì)增生性瘢痕形成的生物學(xué)作用：增生性瘢痕是現(xiàn)代外科治療難點(diǎn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)在組織纖維化中具有重要作用，TGF-β是明顯的促瘢痕形成因子，而TGF-β3可減少TGF-β1、TGF-β2的產(chǎn)生，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成，因此，TGF-β3，有可能是人體內(nèi)在的抗瘢痕形成因子。TGF-β家族是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、ECM合成與代謝的多功能調(diào)節(jié)因子。哺乳類動(dòng)物TGF-β是三種異構(gòu)體，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，而這三種異構(gòu)體在體內(nèi)分別具有不同的功能以維持平衡，這種平衡被打破將會(huì)導(dǎo)致組織器官纖維化。TGF-β1是具特征性的促纖維化形成因子，通過自分泌和旁分泌機(jī)理，刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原及其基質(zhì)成分并沉積。Shah等對(duì)成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和TGF-β2中和抗體有明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖，減少膠原蛋白等ECM合成，而無型別特異性的TGF-β多克隆抗體卻無此作用。因此認(rèn)為纖維化疾病可能是TGF-β異構(gòu)體表達(dá)失衡所致。

3．2　Smad2、Smad7與增生性瘢痕：Smads蛋白家族是近年來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，受體下游信號(hào)蛋白，也是目前公認(rèn)的介導(dǎo)TGF-13。胞內(nèi)反應(yīng)的主要通路。TGF-β1是與瘢痕形成最密切的細(xì)胞因子。Smads是TGF-β1的下游信號(hào)蛋白，Smad2和Smad7分別起正性和負(fù)性調(diào)節(jié)作用。已知在增生性瘢痕中TGF-βⅠ、Ⅱ型受體明顯增加。因此我們推測(cè)，Smad2信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)異常持續(xù)地激活和(或)smad7抑制作用逐漸減弱，是增生性瘢痕形成的原因。Smads在細(xì)胞核內(nèi)的正確定位是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的前提。NSF組織有少量磷酸化Smad2表達(dá)且位于細(xì)胞質(zhì)中；HSF組磷酸化Smad2表達(dá)量增多且位于細(xì)胞核中，表明其可持續(xù)激活靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致增生性瘢痕的形成。

3．3　增生性瘢痕相關(guān)蛋白p311：有學(xué)者曾利用基因芯片技術(shù)，對(duì)燒傷后同體早期HS與正常皮膚組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，找出97條相關(guān)基因并逐一分析，結(jié)果顯示p311(Genebank ID：hsu36189)基因表達(dá)差異顯著。同時(shí)，Pan等也報(bào)道了p311基因的編碼蛋白p311能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而可能影響創(chuàng)傷修復(fù)甚至纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。p311的編碼蛋白由68個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為8×103。p311在細(xì)胞分化過程中可能扮演著轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性的角色。目前之所以關(guān)注P311，一則是因?yàn)閜311基因在早期的HS中呈高表達(dá)，另則是因?yàn)樗軌虼龠M(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。而肌成纖維細(xì)胞又是創(chuàng)傷不全愈合過程以及腫瘤間質(zhì)反應(yīng)中影響纖維化過程的重要靶細(xì)胞。這也暗示P311可能通過肌成纖維細(xì)胞影響創(chuàng)傷修復(fù)甚至纖維化與HS的發(fā)生發(fā)展過程。

3．4　組織缺氧與增生性瘢痕的關(guān)系：缺氧促使成纖維細(xì)胞合成大量的膠原，上調(diào)TGF-β的分泌，TGF-β能夠進(jìn)一步促

進(jìn)膠原的合成，大量膠原纖維的存在勢(shì)必導(dǎo)致氧彌散功能的下降；在創(chuàng)傷后早期肉芽組織內(nèi)就有血管閉塞現(xiàn)象，在增生性瘢痕組織內(nèi)可見大量閉塞、半閉塞性的毛細(xì)血管，與血管內(nèi)壁增多的內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。缺氧導(dǎo)致膠原合成增加和血管閉塞，兩者進(jìn)一步加重缺氧，反復(fù)循環(huán)，最終導(dǎo)致增生性瘢痕的形成，但持續(xù)的缺氧使膠原合成受限使瘢痕轉(zhuǎn)向成熟。用原位雜交技術(shù)對(duì)增生性瘢痕進(jìn)行分析：成纖維細(xì)胞合成Ⅰ、Ⅲ膠原增加，尤其在靠近血管網(wǎng)的部位；TGF-β不但能為成纖維細(xì)胞而且能為血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌。說明TGF-β能通過自分泌、旁分泌調(diào)節(jié)膠原的合成。增生期的增生性瘢痕的氧分壓是降低的，隨著瘢痕的成熟，組織氧分壓才逐漸接近正常組織水平，增生性瘢痕外觀顏色鮮紅，表現(xiàn)為血液供應(yīng)豐富，這與組織低氧分壓表現(xiàn)并不一致，原因在于過度增生的膠原纖維結(jié)節(jié)阻礙了瘢痕組織的氧氣交換，也可能是瘢痕組織增生活躍氧耗增加，使瘢痕組織貌似血供豐富，其實(shí)處在缺氧狀態(tài)。

3．5　皮膚圓錐體結(jié)構(gòu)損傷和增生性瘢痕：梁智等通過對(duì)雌性杜洛克豬(female red duroc pig，F(xiàn)RDP)的皮膚圓錐體結(jié)構(gòu)損傷情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)淺創(chuàng)面組FRDP皮膚圓錐體結(jié)構(gòu)的上半部分受損，但脂肪穹隆以及腺體完好，可見圓點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)和均勻的出血點(diǎn)，愈合后無瘢痕形成。深創(chuàng)面組皮膚圓錐體結(jié)構(gòu)的上半部分缺失、下半部分受損，傷及脂肪穹隆及腺體，未見圓點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)和均勻的出血點(diǎn)，愈合后有瘢痕形成。創(chuàng)面愈合及瘢痕形成情況：淺創(chuàng)面組創(chuàng)面在傷后3周內(nèi)愈合，較為平整，無瘢痕組織形成；深創(chuàng)面組創(chuàng)面愈合時(shí)間在傷后4周以上，較厚、無毛發(fā)、攣縮、質(zhì)地堅(jiān)硬、局部色素變淺或加深。深創(chuàng)面組傷后10、30天皮膚的變化與淺創(chuàng)面組相似，成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞主要存在于圓錐體結(jié)構(gòu)周圍，脂肪穹隆逐漸變小，并被炎性細(xì)胞所填充；傷后150天愈合的創(chuàng)面明顯增厚，有明顯的瘢痕組織形成。深創(chuàng)面組傷后時(shí)間越長(zhǎng)，瘢痕越厚；傷后150天瘢痕增生達(dá)高峰。圓錐體結(jié)構(gòu)的深層部分受損可導(dǎo)致HS的產(chǎn)生。VVG染色計(jì)分顯示，不同深度創(chuàng)面在不同時(shí)相點(diǎn)形成瘢痕的規(guī)律是創(chuàng)面越深，瘢痕越厚。由此說明，皮膚圓錐體結(jié)構(gòu)受損與HS的形成有一定關(guān)系。

第6篇：分子生物學(xué)研究范文

關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎；病毒分子；生物學(xué)檢測(cè)方法

中圖分類號(hào) S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）12- 0110-02

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）導(dǎo)致豬出現(xiàn)脫水、水樣腹瀉以及嘔吐等為主要臨床癥狀的高度傳染性疾病，該病在春季、初秋以及冬季具有較高的發(fā)病率[1]。豬傳染性胃腸炎最早發(fā)生于美國(guó)，隨后在世界各地均有發(fā)生，我國(guó)于20世紀(jì)50年代首次發(fā)現(xiàn)該病，目前全國(guó)大部分地區(qū)均發(fā)生過豬傳染性胃腸炎。不同日齡和品種的豬均可以感染傳染性胃腸炎，其中以15日齡左右的仔豬發(fā)病后死亡率最高，高達(dá)100%；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎后死亡率較低，但是會(huì)影響仔豬后期的生長(zhǎng)，降低仔豬的飼料利用率。目前，該病已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為B類必檢傳染性疾病。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于各種細(xì)菌性和病毒性疾病的檢測(cè)[2]。本文綜述了分子生物學(xué)技術(shù)在傳染性胃腸炎中的應(yīng)用，以期能為從事傳染性胃腸炎診斷和防控的工作者提供幫助。

1 傳染性胃腸炎病毒基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)方式

1.1 TGEV基因組結(jié)構(gòu) 傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒的基因組不分節(jié)段、單股正股RNA，具有高度傳染性。傳染性胃腸炎基因組全序列分為7個(gè)區(qū)29kb，結(jié)構(gòu)序列為5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且該基因組的3'-末端以共價(jià)鍵結(jié)合的poly結(jié)構(gòu)，5'末端有帽結(jié)構(gòu)[3]?；蚪M1約有20kb，主要負(fù)責(zé)病毒的編碼，其余基因均在近3'端。傳染性胃腸炎病毒全基因組編碼由4種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中基因7、基因3和基因1為非結(jié)構(gòu)蛋白，N、M、sM、S為傳染性胃腸炎的結(jié)構(gòu)蛋白。

1.2 基因表達(dá)方式 傳染性胃腸炎病毒在胞漿脫殼以后，其正鏈RNA就呈現(xiàn)了mRNA的功能，使基因1轉(zhuǎn)錄表達(dá)RNA聚合酶，同時(shí)該基因有作為模板合成負(fù)鏈RNA，進(jìn)而親代RNA與負(fù)鏈RNA形成雙鏈復(fù)制中間體。因此，在感染傳染性胃腸炎病毒的細(xì)胞內(nèi)，可以檢測(cè)出不完全RNA、基因組RNA、mRNA以及雙鏈中間體4個(gè)特異性RNA，這可以作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)之一[4]。

2 結(jié)構(gòu)蛋白及功能

豬傳染性胃腸炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要為S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是豬傳染性胃腸炎病毒纖突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，該蛋白基因全長(zhǎng)4.3kb，蛋白分子量為195～220ku；S蛋白不僅是決定豬傳染性胃腸炎病毒抗原的重要結(jié)構(gòu)，也影響著病毒對(duì)細(xì)胞的致病性、親嗜性等。M蛋白是構(gòu)成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前體是由膜外區(qū)、信號(hào)肽、極性區(qū)、跨膜區(qū)突于病毒粒子內(nèi)C-端區(qū)等功能區(qū)域構(gòu)成，分子質(zhì)量為29～31ku；M蛋白不僅決定了病毒粒子的出芽位點(diǎn)和裝配位點(diǎn)，也可以影響病毒變異。N蛋白是一種酸性蛋白質(zhì)，分子量為47KDa，含有382個(gè)氨基酸殘基，該蛋白不僅是豬傳染性胃腸炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)對(duì)病毒基因組的加工、復(fù)制都具有重要作用。sM蛋白分子質(zhì)量為78ku，含有1種小膜蛋白和82個(gè)氨基酸殘基，該功能蛋白在抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的體液和細(xì)胞免疫中具有重要作用。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 核酸探針 核酸探針檢測(cè)方法的基本原理是利用核苷酸堿基互補(bǔ)，在堿基互補(bǔ)過程中，采用標(biāo)記物標(biāo)記與被檢測(cè)靶序列互補(bǔ)的單鏈核酸分子，進(jìn)而檢測(cè)到目的核序列。該檢測(cè)方法與掃描電鏡、熒光抗體試驗(yàn)、病毒分離等相比，具有較好的特異性，并且可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的目的?，F(xiàn)代研究表明[6]，不同的病毒探針可以分別擴(kuò)增出與其對(duì)應(yīng)的病毒模板，對(duì)其他病毒模板影響不大，同時(shí)核酸探針擴(kuò)增的最低檢測(cè)限為3 000～6 000個(gè)拷貝的單個(gè)病毒核酸，具有較高的特異性和敏感性。

3.2 普通RT-PCR方法 該檢測(cè)方法使用的首要條件是知道被檢測(cè)病原的相關(guān)目的基因序列，根據(jù)相關(guān)目的序列后，采用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，然后進(jìn)行體外擴(kuò)增目的基因，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒，并采用相同濃度做重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果顯示RT-PCR擴(kuò)增的特異性條帶為590bp左右；然后又以豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒以及豬輪狀病毒做特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示僅有豬傳染性胃腸炎病毒得到了特異性目的條帶，所以RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)具有較好的重復(fù)性和特異性。

3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR檢測(cè)方法是以普通PCR為基礎(chǔ)發(fā)展的一種新型檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法可以在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，并通過采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多種病原的目的，具有快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前也常用于各種疾病的診斷?；艚鹨萚8]建立了多重RT-PCR法檢測(cè)傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、嵴病毒和A群輪狀病毒的方法，并對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了敏感性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，多重RT-PCR法可以檢測(cè)出50TCID50的混合病毒，且能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為275bp、544bp、750bp的3條特異性片段，具有較高的特異性和敏感性，可以在臨床上推廣使用。

3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)引物，并通過2次擴(kuò)增對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，該方法相對(duì)其他PCR檢測(cè)方法，具有較高的敏感性，且節(jié)約成本?，F(xiàn)代研究表明，PCR技術(shù)在檢測(cè)病毒時(shí)，可以省略不同病毒分離的過程，具有較高的敏感性和特異性，而套式PCR方法在病毒粒子較少的情況下依然能夠檢測(cè)出，表明套式PCR比常規(guī)PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR檢測(cè)豬呼吸道冠狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的S基因序列，根據(jù)兩組病毒的基因序列分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，然后分別以豬呼吸道冠狀病毒細(xì)胞和豬傳染性胃腸炎病毒細(xì)胞為模板進(jìn)行套式PCR特異性片段擴(kuò)增，結(jié)果顯示，豬呼吸道冠狀病毒擴(kuò)增的基因片段為214bp，豬傳染性胃腸炎病毒擴(kuò)增的基因片段為886bp，同時(shí)檢測(cè)出了這種病毒，具有較高的特異性和敏感性。

3.5 熒光定量RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的原理是在PCR反應(yīng)體系中采用熒光探針標(biāo)記法或加入了SYBR GreenI熒光染料標(biāo)記PCR的反應(yīng)產(chǎn)物，然后使用反應(yīng)儀器收集反應(yīng)產(chǎn)物的熒光信號(hào)，并根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱確定產(chǎn)物的量，進(jìn)而達(dá)到與起始模板準(zhǔn)確定量的目的。該檢測(cè)方法與常規(guī)RT-PCR相比，不需要進(jìn)行電泳試驗(yàn)檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)果更為直觀、方便，同時(shí)又避免了因電泳試驗(yàn)對(duì)環(huán)境造成污染。王建中等[10]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病病毒的S基因序列設(shè)計(jì)了引物，并通過多組試驗(yàn)對(duì)熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，優(yōu)化后的檢測(cè)方法對(duì)其他病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，檢測(cè)結(jié)果的敏感性高達(dá)43.07拷貝/μL，是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的100倍，具有較高的敏感性和特異性。

3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近幾年新興的一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，因其具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測(cè)速度以及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒病和細(xì)菌病檢測(cè)。高睿澤等[11]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒的N基因建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法的敏感性和特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，該方法在63℃下可以使豬傳染性胃腸炎病毒N基因獲得較高的特異性擴(kuò)增，且與豬流行性腹瀉病毒等物交叉反應(yīng)，具有加高的特異性；同時(shí)該檢測(cè)方法可以檢測(cè)到131.4fg/μL的DNA，其靈敏度比常規(guī)PCR高出3個(gè)數(shù)量級(jí)。

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第7篇：分子生物學(xué)研究范文

摘要 瑞氏木霉是自然界中普遍存在并有重要經(jīng)濟(jì)意義的一種絲狀真菌，作為工業(yè)生產(chǎn)菌株生產(chǎn)多種水解酶類已有多年歷史。本文報(bào)道了用基因工程手段對(duì)瑞氏木霉進(jìn)行遺傳改造，構(gòu)造具新性狀的重組菌株，用以過量產(chǎn)生同源和異源蛋白類物質(zhì)的分子生物學(xué)研究進(jìn)展。包括利用CBHI基因的強(qiáng)啟動(dòng)子在瑞氏木霉中過量表達(dá)瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶、小牛凝乳蛋白酶、人抗體片段、哈茨木霉幾丁質(zhì)酶、Hormoconis葡萄糖淀粉酶等同源和異源蛋白以及利用在葡萄糖上強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子生產(chǎn)纖維素酶等遺傳工程進(jìn)行情況。

關(guān)鍵詞瑞氏木霉；遺傳改造；基因定位置換整合；重組蛋白

1 前言

多年以來，絲狀真菌及其產(chǎn)生的酶類已廣泛用于食品和食品加工業(yè)。由于其在工業(yè)上的巨大應(yīng)用潛力，促進(jìn)了大規(guī)模發(fā)酵工程、下游加工工程和對(duì)菌株的遺傳改造的發(fā)展，其結(jié)果有助于將絲狀真菌進(jìn)一步應(yīng)用于當(dāng)今的工業(yè)生產(chǎn)。大多數(shù)情況下，自然發(fā)生的菌株產(chǎn)生我們所需蛋白的水平很低，以至不能在商業(yè)上加以利用。因此，為了得到所需的目的蛋白，需對(duì)自發(fā)菌株進(jìn)行遺傳改造。隨著分子遺傳技術(shù)和真菌基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的發(fā)展，利用基因工程方法對(duì)絲狀真菌進(jìn)行有目的的遺傳改造，已以成為可能。

絲狀真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是多細(xì)胞的真核微生物，其作為工業(yè)菌株用于生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年歷史。瑞氏木霉所產(chǎn)生的一種主要的纖維酶一纖維二糖水解酶I（cellobiohydrolase1），由單拷貝基因編碼，其產(chǎn)量可達(dá)瑞氏木霉胞外分泌性蛋白總量的50%[1]。由此可見，cbh1啟動(dòng)子是很強(qiáng)的啟動(dòng)子。因此在對(duì)瑞氏木霉的遺傳改造中，常利用cbh1的啟動(dòng)子與終止子序列構(gòu)建載體，并利用cbh1的前導(dǎo)肽序列引導(dǎo)重組蛋白進(jìn)行分泌性表達(dá)。瑞氏木霉具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌機(jī)制，很可能還具有與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)相似的蛋白修飾性能，如：高甘露糖型和N-糖基化[2]等。由于瑞氏木霉具有以上優(yōu)良性能，再加之其工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵條件已比較成熟，這些都促進(jìn)了對(duì)瑞氏木霉的遺傳改造，為同源或異源分泌性蛋白的產(chǎn)生提供了一條行之有效的途徑。

瑞氏木霉不僅具有適于蛋白生產(chǎn)的諸多優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)人沒有毒性，在產(chǎn)酶條件下也不產(chǎn)生真菌毒素和抗生素。近年來的實(shí)踐表明，經(jīng)過基因工程手術(shù)改造的瑞氏木霉重組菌株是安全無害的[3]。

2 過量生產(chǎn)同源蛋白一纖維素酶與木聚糖酶的生產(chǎn)

纖維素酶廣泛用于淀粉加工、谷物酒精發(fā)酵、麥芽制備和釀造、動(dòng)物飼養(yǎng)以及青貯飲料加工、果汁和蔬菜汁的提取等諸多方面，近年來被應(yīng)用于紡織、造紙、制漿等工業(yè)。由于纖維素酶應(yīng)用范圍極其廣泛，使得開發(fā)和改造纖維素酶生產(chǎn)菌株具有極強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。瑞氏木霉具有降解纖維素的完全酶系，所分泌的纖維素酶混合物通常包括內(nèi)切葡聚糖酶等多種酶活力。

1990年，Harkki等報(bào)道，通過基因定位置換整合使編碼CBHI的基因失活，結(jié)果EGI的產(chǎn)量提高，不再產(chǎn)生CBHI[4]（見圖1）。1993年，Karhunen等報(bào)道，將編碼EGI的基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子cbh1的控制之下，用此表達(dá)盒替換染色體的cbh1位點(diǎn)之后，EGI的產(chǎn)量是通常強(qiáng)纖維素分解菌所得CBHI量的2倍或者與其一樣多[5]。其他人也曾報(bào)道過類似的情況。瑞氏木霉的一個(gè)或幾個(gè)纖維素酶基因經(jīng)基因位定位置換整合而失活[6，7]。這些菌株提供了一系列令人感興趣的新酶混合物，即可用于工業(yè)生產(chǎn)，又可用于研究不同酶組分對(duì)各種纖維底物的分解作用。

但是，基因失活和基因置換的方法，可能不適用于需極高特異和必須去除非必需酶活力的酶制劑。這是因?yàn)橛糜诿干a(chǎn)的培養(yǎng)基，可能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量其它水解酶類。而要使編碼這些酶的基因都失活，在實(shí)際當(dāng)中幾乎是不可能的。為了防止這類問題的產(chǎn)生，Goldman(1992)、Schindler（1993）Nakari(1995)等人先后報(bào)道從瑞氏木霉中分離了非纖維素酶基因的啟動(dòng)子，包括pgk啟動(dòng)子、pkiA啟動(dòng)子、tefl啟動(dòng)子和一個(gè)在葡萄糖培養(yǎng)基上強(qiáng)表達(dá)但未知的cDNA1的啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子可以在葡萄糖培養(yǎng)基上啟動(dòng)合成所需要的纖維素酶，產(chǎn)生的酶制劑基本上沒有其它纖維素酶活力。在cDNA1啟動(dòng)子控制下所合成的纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚酶產(chǎn)量最高可達(dá)50-100mg/L，占分泌蛋白總量50%以上[8]。1996年，Kurzatkowski等構(gòu)建了能在葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的瑞氏木霉的重組菌株，其攜帶的木霉糖酶Ⅰ或木霉糖酶Ⅱ結(jié)構(gòu)基因是在內(nèi)源丙酮酸激酶基因（pkil）表達(dá)信號(hào)的控制之下表達(dá)。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫染色，發(fā)現(xiàn)這兩種類型的轉(zhuǎn)化體在葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，能分別分泌出木霉糖酶Ⅰ和木霉糖酶Ⅱ。對(duì)于木霉糖酶來說，最好的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的特異性酶活力為76U/mg；而對(duì)于木霉糖酶Ⅱ來說，則為145U/mg；都大大高出于自發(fā)菌株所產(chǎn)生的26U/mg[9]。

3 異源蛋白的生產(chǎn)

3.1真菌酶蛋白類

將Trichoderma harzianum P1染色體上的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因分離，導(dǎo)入絲狀真菌瑞氏木霉，并在cbh1啟動(dòng)子過量表達(dá)。出發(fā)菌株瑞氏木霉RutC-30不具有任何內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力。T·harzianum內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因編碼區(qū)前的區(qū)段的瑞氏木霉中能正確發(fā)揮功能。搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)生130mg/L有活力的幾丁質(zhì)酶，比T·harzianum產(chǎn)生的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力提高大約20倍。瑞氏木霉RutC-30似乎能忍受內(nèi)切幾丁質(zhì)酶具有抗植物病原真菌的活力[10]，已被用于植物病源真菌的生物防治。另據(jù)B.Cubero等（1997）報(bào)道，在瑞氏木霉組成型啟動(dòng)子ki和cbh2終止子的控制之下構(gòu)建了兩種載體，分別含有T·harzianum的基因chit33和bgn16.2的開放閱讀框（chit33編碼一種內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，bgn16.2編碼一種外切葡萄糖淀粉酶），并獲得了穩(wěn)定的拷貝轉(zhuǎn)化體。對(duì)轉(zhuǎn)化體bng16.2來說，整合到基因組中的基因拷貝數(shù)與mRNA和蛋白質(zhì)的積累量和在葡萄糖阻遏或幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)條件下的胞外牧特性酶活力之間均呈正相關(guān)。該菌株比野生型菌株能更迅速地抑制病原真菌的生長(zhǎng)。對(duì)轉(zhuǎn)化體chit33來說，在葡萄糖阻遏的條件下。對(duì)轉(zhuǎn)化體chit33來說，在葡萄糖阻遏的條件下，其產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶活力是野生菌株的10倍[11]。

Joutsjoki VV(1994)報(bào)道，構(gòu)建了兩種一步基因置換載體。一種載體含有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P的基因組基因（gamP），另一種含有相應(yīng)的cDNA，都在瑞氏木霉cbh1啟動(dòng)子控制下表達(dá)。這些載體經(jīng)轉(zhuǎn)化后置換瑞氏木霉的cbh1基因。在這兩種載體中，cbh1啟動(dòng)子都能精確地連接到gamP蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游，指導(dǎo)瑞氏木霉分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。這表明gamP基因中內(nèi)含子序列在瑞氏木霉中得到了正確的加工。研究結(jié)果表明，含有g(shù)amP cDNA的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體能分泌大約700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中產(chǎn)量的20倍[12]，但chb1基因被gamP基因組基因置換的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化體，所分泌的有活性的GAMP要多于含有3拷貝cDNA的轉(zhuǎn)化體。對(duì)瑞氏木霉分泌H.nisresinae葡萄糖淀粉酶P的研究結(jié)果表明，自然狀態(tài)未成熟GAMP的N端延伸部分可以在瑞氏木霉中作為一種有效的分泌信號(hào)，所產(chǎn)生的胞外葡萄糖淀粉酶活力高于以CBHI信號(hào)肽作為分泌信號(hào)時(shí)的情況[13]。

酵母基因在瑞氏木霉中表達(dá)的一例是：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DPM1基因（編碼甘露糖基磷酸多萜醇合成酶）的編碼區(qū)插入到pLMRS3質(zhì)粒中，在瑞氏木霉pki啟動(dòng)子和cbh2終止子控制下表達(dá)。在pFG1質(zhì)粒（含有瑞氏木霉pyr4基因）存在下，與pLMRS3質(zhì)粒一起對(duì)瑞氏木霉的一種pyr4陰性突變株TU-6進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。然后篩選pyr4陽性轉(zhuǎn)化子，得到4株多拷貝DPM1基因串聯(lián)整合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。與受體菌株TU-6相比，轉(zhuǎn)化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白總量也提高了4倍[14]。

除以上蛋白外，被表達(dá)的真菌蛋白還包括肌醇六磷酸酶等。這些酶都是在cbh1啟動(dòng)子下表達(dá)，搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)量達(dá)100mg/L水平。發(fā)酵培養(yǎng)中，產(chǎn)量為每升幾克。在cbh1啟動(dòng)子的控制之下，來自擔(dān)子菌綱的真菌Phlebia radiate的氧化還原酶（如：漆酶）的產(chǎn)量也達(dá)到中等水平

3.2哺乳動(dòng)物蛋白

瑞氏木霉已被用于牛凝乳蛋白酶的生產(chǎn)。利用cbh1啟動(dòng)子和終止子，通過共轉(zhuǎn)化外源基因與來自構(gòu)巢曲霉（Asp.nidulans）的amdS基因一起引入乙酰胺非利用型菌株。測(cè)量到的凝乳酶mRNA和分泌出的凝乳酶的量要比相應(yīng)的cbh1 mRNA和CBHI的量低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。這表明牛凝乳蛋白酶在瑞氏木霉中的表達(dá)受到了轉(zhuǎn)錄限制。但是，所獲得的40mg/L的水平，與典型的在構(gòu)巢曲霉素中的2-10mg/L的最初水平相比，還是一個(gè)可喜的進(jìn)步[15，16]。

另外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用其它絲狀真菌生產(chǎn)的幾種人體蛋白是：表皮生長(zhǎng)因子（hEGF），生產(chǎn)激素（hGH），白細(xì)胞介素6，組織血纖維蛋白溶酶原激活因子（htPA）等。

Fab分子是由抗體完整的輕鏈和重鏈的Fd部分，由鏈間二硫鏈連接在一起。這種分子曾由木霉成功地生產(chǎn)出來，并用于研究其分泌過程。利用cbh1啟動(dòng)子和信號(hào)序列，分別構(gòu)建了表達(dá)輕鏈和重鏈的表達(dá)盒。首先構(gòu)建的是只產(chǎn)生輕鏈的菌株，然后用2種不同的重鏈表達(dá)載體進(jìn)行再轉(zhuǎn)化。這兩種載體分別指導(dǎo)Fd鏈或者與CBHI核心-連接區(qū)融合在Fd鏈的表達(dá)。只產(chǎn)生輕鏈的菌株分泌的輕鏈水平很低（0.2mg/L）。對(duì)前一種重鏈載體的轉(zhuǎn)化體來說，在搖瓶培養(yǎng)中，分泌的有可能的Fab分子為1mg/L。在具有cbh1-Fd融合結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化體菌株中，觀察到產(chǎn)量有顯著增長(zhǎng)。最優(yōu)菌株能分泌40mg/L具有免疫活力的CHBI-Fab融合蛋白。在發(fā)酵培養(yǎng)中，水平增長(zhǎng)到150mg/L.然而，沒有融合到CBHI上的Fab分子，水平仍為1mg/L。有趣的是，一種未知的木霉蛋白酶在CBHI-Fab融合蛋白的N-端特異去除2個(gè)氨基酸，能產(chǎn)生少量的Fab分子。釋放的Fab分子表現(xiàn)出免疫活性和對(duì)抗原的親和性，而CBHI-Fab分子的免疫活性要低5-12倍。對(duì)分離到的抗體鏈進(jìn)行定量測(cè)定表明，分泌出的所有輕鏈都和重鏈組裝在一起。CBHI-Fab產(chǎn)物的上清液中，含有顯著數(shù)量（800mg/L）的CBHI核心-連接區(qū)肽，它們來自CBHI-Fd融合分子。這樣，CBHI-Fd的產(chǎn)生是非常有效的（大于800mg/L），但其中只有少量（40mg/L）裝配成有功能的CBHI-Fab分子（或者，釋放的Fab分子）。這表明輕鏈的產(chǎn)生可能是限制性因素[17，18]。

4 總結(jié)

絲狀真菌瑞氏木霉已被成功地用于生產(chǎn)同源和異源蛋白。利用基因工程構(gòu)建具新生狀的菌株，在蛋白類物質(zhì)的生產(chǎn)方面已取得重要進(jìn)展。其中，在提高絲狀真菌異原蛋白產(chǎn)量的過程中，基因融合的方法特別值得注意。典型作法是，將編碼有目的蛋白的基因融合到自然情況下分泌性良好的內(nèi)源蛋白基因如葡萄糖淀粉酶、纖維二糖水解酶基因的下游。這種方法已在由Asp.awamori分泌牛凝乳蛋白酶（Ward等，1990），Asp.nidulans分泌白細(xì)胞介素6的過程中，被證明有效的（Contreras等，1991）。有趣的是，當(dāng)外源蛋白整合到CBHI核心-連接區(qū)上時(shí)，產(chǎn)量能夠提高。在牛凝乳蛋白酶的例子中，產(chǎn)量提高3-5倍；就抗體片段而言，產(chǎn)量提高50多倍（Nyysonen等地993）。

由上可見，在瑞氏木霉中已發(fā)現(xiàn)出多種分子系統(tǒng)，采用不同的策略用于同源和異源蛋白的生產(chǎn)。為了提高產(chǎn)量，使用強(qiáng)表達(dá)和有效分泌纖維素酶CBHI基因的不同部分，已被證明是一種有效的方法。雖然在基因組的分區(qū)段也可獲得外源基因的有效表達(dá)，但cbh1啟動(dòng)子很強(qiáng)，而且cbh1位點(diǎn)對(duì)于表達(dá)似乎也有益。將外源蛋白融合到CBHI的核心-連接區(qū)，能夠恢復(fù)對(duì)高水平表達(dá)起重要作用的區(qū)段，如：翻譯起始位點(diǎn)、信號(hào)肽序列及其作用位點(diǎn)。通過基因工程和發(fā)醇培養(yǎng)生產(chǎn)同源和異源蛋白，需要進(jìn)一步地改進(jìn)。對(duì)于不同的培養(yǎng)條件，包括含葡萄糖的培養(yǎng)基，應(yīng)該發(fā)展出不同的生產(chǎn)策略，策略和技術(shù)的發(fā)展將會(huì)拓寬瑞氏木霉生產(chǎn)重組蛋白的范圍。由于瑞氏木霉在大規(guī)模生產(chǎn)條件中（高達(dá)360m2發(fā)酵液）的良好表現(xiàn)，所以它特別適于所需大量蛋白的生產(chǎn)[19]。遺憾的是，目前國(guó)內(nèi)在這方面的研究尚未見報(bào)導(dǎo)。山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室正在開展對(duì)于瑞氏木霉的分子生物學(xué)研究，已克隆到瑞氏木霉進(jìn)行菌株改造，通過基因定位置換整合，破壞其木糖醇脫氫酶基因，從而構(gòu)建木糖醇生產(chǎn)菌。

隨著瑞氏木霉分子生物學(xué)研究的開展及基因工程的瑞氏木霉的應(yīng)用，使我們構(gòu)建多種具有良好商業(yè)潛力的菌株成為可能。我們相信利用木霉大量生產(chǎn)多種酶和藥用產(chǎn)品，將不斷被證明是行之有效的。

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第8篇：分子生物學(xué)研究范文

關(guān)鍵詞：生命科學(xué)；國(guó)際化人才培養(yǎng)；分子生物學(xué)

中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2015）37-0073-02

《國(guó)家中長(zhǎng)期教育改革和發(fā)展規(guī)劃綱要（2010-2020年）》明確提出，要開展多層次、寬領(lǐng)域的教育交流與合作，提高我國(guó)研究生教育國(guó)際化水平。必須承認(rèn)，我國(guó)目前在生命科學(xué)學(xué)生教育方面，無論是本科生還是研究生，與國(guó)外學(xué)生的教育國(guó)家化發(fā)展模式和效果還存在巨大差異，因此以國(guó)外生命科學(xué)學(xué)生的教育國(guó)際化的發(fā)展經(jīng)驗(yàn)為參考，構(gòu)建適合中國(guó)國(guó)情的國(guó)際化培養(yǎng)模式，對(duì)于提升我國(guó)生命科學(xué)學(xué)生的教育水平和層次具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，生命科學(xué)已經(jīng)成為世界科學(xué)前沿最活躍的學(xué)科，是代表科學(xué)發(fā)展方向的學(xué)科之一。目前在世界范圍內(nèi)逐漸形成了這樣的共識(shí)：生物技術(shù)將成為21世紀(jì)主導(dǎo)社會(huì)發(fā)展的主要支柱產(chǎn)業(yè)之一。人類正在進(jìn)入生物學(xué)時(shí)代，生物學(xué)正在越來越多地被應(yīng)用于解決醫(yī)藥領(lǐng)域問題、科技制造業(yè)、綠色能源以及農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護(hù)等很多重大方面。而美國(guó)白宮也在2012年了“國(guó)家生物經(jīng)濟(jì)”藍(lán)圖，提出未來美國(guó)政府在生物經(jīng)濟(jì)方面的戰(zhàn)略性使命。在這一新形勢(shì)下，把培養(yǎng)具備國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)能力的以及一定自主創(chuàng)新能力的高素質(zhì)的創(chuàng)新型人才作為生命科學(xué)學(xué)生培養(yǎng)的目標(biāo)，并在構(gòu)建生命科學(xué)學(xué)科學(xué)生的國(guó)際化培養(yǎng)的新模式方面進(jìn)行有益的嘗試將變得異常重要。有很多學(xué)者發(fā)表關(guān)于哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院人才培養(yǎng)模式的論文，如喬敏等的《學(xué)習(xí)哈佛經(jīng)驗(yàn)建立基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)整合課程體系的實(shí)踐》、袁力的《中美大學(xué)本科課程體系比較及啟示》、于歆杰的《麻省理工學(xué)院教育教學(xué)考察報(bào)告（二）――培養(yǎng)方案與課程設(shè)置篇》、蔣景華《麻省理工學(xué)院培養(yǎng)創(chuàng)新人才特色做法的分析研究》等，但關(guān)于國(guó)外生命科學(xué)人才培養(yǎng)模式的文章很少，只檢索到肖尊安的《淺析國(guó)外大學(xué)生物科學(xué)人才的培養(yǎng)》和夏薇的《麻省理工學(xué)院和清華大學(xué)生物學(xué)專業(yè)課程設(shè)置比較》等。近年來我國(guó)的高等生命科學(xué)人才培養(yǎng)已加快了改革和調(diào)整的步伐并取得了一些成果。清華大學(xué)、北京大學(xué)生命科學(xué)人才培養(yǎng)與科學(xué)研究改革試點(diǎn)已經(jīng)考試啟動(dòng)，其總目標(biāo)是：在清華大學(xué)生命科學(xué)中心和北京大學(xué)生命科學(xué)中心的基礎(chǔ)上，建立生命科學(xué)人才培養(yǎng)與科學(xué)研究改革試點(diǎn)（簡(jiǎn)稱改革試點(diǎn)），兩個(gè)中心研究方向各有側(cè)重，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，資源共用，統(tǒng)一實(shí)施和管理，并為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)制定了明確的改革措施。吉林大學(xué)、浙江大學(xué)、武漢大學(xué)等國(guó)內(nèi)一流大學(xué)已經(jīng)紛紛開始進(jìn)行生命科學(xué)學(xué)生國(guó)際化培養(yǎng)模式的改革。而分子生物學(xué)做為現(xiàn)代生命科學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科，發(fā)展異常迅猛，以分子生物學(xué)課程為探索國(guó)際化培養(yǎng)模式的試點(diǎn)非常必要。因此，我們?cè)谶|寧大學(xué)生命科學(xué)院以中英雙語教學(xué)課程分子生物學(xué)課程為例，進(jìn)行了一系列的改革措施，借以探索生命科學(xué)本科學(xué)生的國(guó)際化培養(yǎng)模式。

一、改革的目標(biāo)及具體改革內(nèi)容

以分子生物學(xué)課程的國(guó)際化實(shí)踐為試點(diǎn)，為進(jìn)行遼寧大學(xué)生命科學(xué)院現(xiàn)代生命科學(xué)國(guó)際化人才培養(yǎng)模式的探討提供參考。

1.教學(xué)理念方面的改革：分子生物學(xué)課程是一門嶄新的課程，作為現(xiàn)代生命科學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科，發(fā)展異常迅猛。這就要求分子生物課程的教學(xué)理念也要符合其發(fā)展特點(diǎn)。在教學(xué)理念上破除陳舊的照本宣科和一成不變的教學(xué)模式，發(fā)揮教師的主動(dòng)性和創(chuàng)新性，鼓勵(lì)教師從自己的學(xué)術(shù)科研實(shí)踐出發(fā)，把前沿的學(xué)科發(fā)展動(dòng)態(tài)同教材內(nèi)容相結(jié)合，拓寬專業(yè)教育范圍，把培養(yǎng)國(guó)際型實(shí)用人才做為教學(xué)理念貫穿整個(gè)教學(xué)過程。

2.教學(xué)內(nèi)容方面的改革：分子生物學(xué)的前沿發(fā)展非常深入和迅速，這就要求分子生物學(xué)教學(xué)內(nèi)容設(shè)置的最重要的標(biāo)準(zhǔn)必須是強(qiáng)調(diào)教材內(nèi)容的先進(jìn)性，這樣才能保證所傳授的內(nèi)容不落伍。改變之前所用傳統(tǒng)分子生物學(xué)的中文教材，通過使用與國(guó)際接軌的先進(jìn)教材《Molecular Biology of the Gene》（科學(xué)出版社，J.D.，沃森等編著，楊煥明等譯），以及自制的以該教材英文版為參考的全英文PPT課件，使教學(xué)的內(nèi)容始終保持與學(xué)科的前沿發(fā)展契合（圖1）。同時(shí)在每學(xué)期的教學(xué)中都根據(jù)學(xué)科發(fā)展的現(xiàn)狀，合理并及時(shí)運(yùn)用該教材編撰者在冷泉港實(shí)驗(yàn)室隨時(shí)更新的最新的分子生物學(xué)教學(xué)動(dòng)畫及其他教學(xué)材料（圖2），以及哈佛大學(xué)或麻省理工學(xué)院相關(guān)課程的教學(xué)輔助參考資料，這樣做到隨時(shí)進(jìn)行知識(shí)更新，以跟進(jìn)教材更新和修訂周期中的學(xué)科發(fā)展動(dòng)態(tài)，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。

3.教學(xué)方法方面的改革：分子生物學(xué)是一門理論和教學(xué)結(jié)合非常緊密的學(xué)科。任何一個(gè)知識(shí)點(diǎn)都從具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得來，而學(xué)術(shù)和實(shí)驗(yàn)?zāi)芰κ欠肿由飳W(xué)教學(xué)的一個(gè)重要指標(biāo)。在教學(xué)實(shí)踐中理論部分利用研究式、討論式（如第三四五章分子間的弱相互作用重要性的討論，為分子生物學(xué)相關(guān)化學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，由討論課形式完成）、啟發(fā)式、等教學(xué)方法，以解決問題為出發(fā)點(diǎn)，將某些相關(guān)的理論形成過程分析出來，并就形成過程中的一些關(guān)鍵知識(shí)點(diǎn)提出問題，促進(jìn)學(xué)生思考，培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)術(shù)研究精神。另外，開展多彩多樣的課外活動(dòng)，包括小型研究課題、實(shí)驗(yàn)技術(shù)訓(xùn)練和知識(shí)拓展講座等。同時(shí)，開展“本科生導(dǎo)師制”工作，鼓勵(lì)學(xué)生參與任課教師的學(xué)術(shù)科研實(shí)踐，以實(shí)現(xiàn)教學(xué)與科研相互促進(jìn)的目標(biāo)。

4.考核標(biāo)準(zhǔn)改革：改變?cè)荚囍恢匾暺谀┛荚嚲砻娉煽?jī)的做法，分子生物學(xué)考試改革改為出勤率、平時(shí)學(xué)術(shù)小論文報(bào)告、課堂討論及發(fā)表并結(jié)合期末卷面成績(jī)的做法，監(jiān)督和培養(yǎng)學(xué)生平時(shí)夯實(shí)學(xué)習(xí)基礎(chǔ)知識(shí)的好習(xí)慣，并激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新思維能力的培養(yǎng)。

二、具體實(shí)施方案

1.建立國(guó)際化的教學(xué)隊(duì)伍與科學(xué)、公正的評(píng)價(jià)制度：引進(jìn)具有國(guó)際化背景的分子生物學(xué)專業(yè)的教師承擔(dān)部分教學(xué)任務(wù)，通過開展廣泛的討論與監(jiān)督，評(píng)價(jià)學(xué)生對(duì)該學(xué)科的學(xué)習(xí)成果。

2.寓教于研，建立國(guó)際化的拔尖創(chuàng)新人才的培養(yǎng)體系：以遼寧大學(xué)本科生導(dǎo)師制度為依托，吸引優(yōu)秀的本科學(xué)生參與到任課教師的學(xué)術(shù)實(shí)踐中。通過課題中子課題任務(wù)的承擔(dān)和參與，強(qiáng)化其對(duì)分子生物學(xué)課程的理解，提高其興趣。

3.制定國(guó)際化的分子生物學(xué)課程教學(xué)指導(dǎo)方案。構(gòu)建國(guó)際化的本科生培養(yǎng)方案，將為提高研究生的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)能力奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。通過借鑒國(guó)外高水平生命科學(xué)學(xué)科的課程體系，進(jìn)一步優(yōu)化了課程結(jié)構(gòu)，制定符合自身特色的本科生國(guó)際化培養(yǎng)方案。

4.開展多種形式的國(guó)際化學(xué)術(shù)交流活動(dòng)。遼寧大學(xué)生命科學(xué)院的承擔(dān)分子生物學(xué)及相關(guān)課程如基因工程、分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等專業(yè)的任課教師絕大多數(shù)都有海外工作或者留學(xué)經(jīng)歷，并且與國(guó)外保持著密切的聯(lián)系。分子生物學(xué)教研室充分利用這些教師資源，利用遼寧大學(xué)的“暑假小學(xué)期”制度，定期邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)外分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的專家及學(xué)者來院講學(xué)及交流，為學(xué)生開設(shè)各種形式的前沿講座和報(bào)告。這些措施使學(xué)生能夠與外籍專家近距離的交流和學(xué)習(xí)，讓學(xué)生能深刻體會(huì)到國(guó)外先進(jìn)的教育理念和教學(xué)方式，感受國(guó)外先進(jìn)的教育理念和教學(xué)方式，領(lǐng)略國(guó)際一流學(xué)者的風(fēng)度和學(xué)識(shí)，從而激發(fā)學(xué)生的求知欲，為他們?cè)趪?guó)際學(xué)術(shù)舞臺(tái)上展現(xiàn)自己的渴望增加了助力。

通過以上改革，學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)課程學(xué)習(xí)的興趣顯著提升，課堂出勤率顯著增加，學(xué)習(xí)成績(jī)也有大幅度提高。同時(shí)，通過對(duì)分子生物學(xué)課程學(xué)習(xí)的引導(dǎo)，學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科如細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等以及其他生命科學(xué)學(xué)科產(chǎn)生了濃厚的興趣，對(duì)提振生命科學(xué)本科學(xué)生的學(xué)習(xí)風(fēng)氣起到了積極的促進(jìn)作用。學(xué)生的國(guó)際化視野得到了拓展，用英語討論分子生物學(xué)學(xué)術(shù)研究熱點(diǎn)的能力得到了鍛煉，對(duì)國(guó)際學(xué)術(shù)環(huán)境有了較為整體的了解，而這些也使得本院本科生在聯(lián)系國(guó)際知名大學(xué)繼續(xù)求學(xué)深造的過程中競(jìng)爭(zhēng)力大大提高，并且陸續(xù)獲得了美國(guó)和日本等國(guó)際知名大學(xué)的錄取。通過以上實(shí)踐，希望我們的分子生物學(xué)課程教學(xué)改革對(duì)生命科學(xué)國(guó)際化人才培養(yǎng)模式能有所參考。

參考文獻(xiàn)：

第9篇：分子生物學(xué)研究范文

百日草（zinnia elegans）屬菊科百日草屬的1a生草本植物，是重要的園林觀賞花卉；其葉片花序可入藥，有消炎，祛濕熱的作用。在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校園內(nèi)種植有大量的百日草，調(diào)查發(fā)現(xiàn)百日草白粉病發(fā)生較為嚴(yán)重，主要危害植株的葉、葉柄和花瓣，孢子堆生于葉片正、反面 、葉柄和花瓣上。發(fā)病初期，葉面出現(xiàn)零星的白色小粉斑，擴(kuò)大后為圓形病斑，白粉斑可相互連接成片，有時(shí)白粉層覆蓋整個(gè)葉片[1]。目前國(guó)內(nèi)尚未見關(guān)于百日草白粉病無性孢子生物學(xué)特性的系統(tǒng)研究報(bào)道[2-3]，為此，本試驗(yàn)為百日草白粉病無性孢子生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為防治百日草白粉病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

百日草白粉病無性孢子采自百日草白粉病無性孢子采自新城局農(nóng)業(yè)站院內(nèi)發(fā)生白粉病的百日草的病葉上；供試碳源為蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、淀粉；供試氮源為谷氨酸、硝酸鈉、硝酸銨、硝酸鈣、氯化銨、尿素；其他本文由收集整理材料有0.1%naoh溶液、0.1%hcl溶液等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 不同溫度培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

取新鮮的洋蔥表皮1㎝×1㎝，在75%酒精中浸泡1周，再取出洋蔥表皮放入無菌水中清洗。用清洗過的洋蔥表皮蘸取適量的百日草病葉上的白粉病無性孢子，在顯微鏡4倍鏡下單一視野內(nèi)孢子數(shù)量不少于30個(gè)，觀察記錄總數(shù)不少于200個(gè)。將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮置于盛有無菌水的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿3片。將培養(yǎng)皿分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒溫生化培養(yǎng)箱（shp-1500，中國(guó)上海精宏有限公司）中，共7個(gè)處理，3次重復(fù)，培養(yǎng)48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

1.2.2 不同光照培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

按照2.2.1的方法將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮置于盛有無菌水的培養(yǎng)皿中，分別置于全光照、全黑暗、光暗交替條件下于恒溫生化培養(yǎng)箱中[4]，共3個(gè)處理，3次重復(fù)，培養(yǎng)48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

1.2.3 不同ph培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

按照2.2.1的方法將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮分別置于盛有以0.1%naoh溶液和0.1%hcl溶液配置的ph為4、5、6、7、8、9、10的培養(yǎng)皿中[5-6]，共7個(gè)處理，3次重復(fù)，置于25℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

1.2.4 不同碳源培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

按照2.2.1的方法將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮置于盛有0.5%葡萄糖溶液的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿3片。再分別以蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉代替葡萄糖，共5個(gè)處理，3次重復(fù)，置于25℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

1.2.5 不同氮源培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

按照2.2.1的方法將蘸有病菌無性孢子的洋蔥表皮置于盛有0.2%谷氨酸溶液的培養(yǎng)皿中。再分別以硝酸鈉、硝酸銨、硝酸鈣、氯化銨、尿素代替谷氨酸，共6個(gè)處理，3次重復(fù)，置于25℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，將洋蔥表皮置于載玻片上在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌況。

2 結(jié)果與分析

不同溫度培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響 見表1。

由表1可見，不同溫度對(duì)孢子萌發(fā)率有較大的影響，其中25℃處理與其它處理間有顯著性差異，但并未達(dá)到極顯著水平。所以，25℃更適于百日草白粉病無性孢子的萌發(fā)。其中5℃、10℃、35℃萌發(fā)率極低，說明低溫及高溫對(duì)孢子萌發(fā)有抑制作用。

不同光照培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響 見表2。

由表2可見，記錄的數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析后，光暗交替與全光照、全黑暗有顯著性差異，但無極顯著性差異；全光照與全黑暗之間無差異。因此最適光照條件為光暗交替。

2.3 不同ph值培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響 見表3。

由表3可見，在ph=4～10范圍內(nèi)均可萌發(fā)，其中ph=8與其它處理間差異顯著。孢子萌發(fā)率最快即為孢子萌發(fā)最適ph值。ph=4、ph=10的處理孢子萌發(fā)率較低，說明強(qiáng)酸，強(qiáng)堿對(duì)孢子萌發(fā)有抑制作用。

2.4 不同碳源培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

見表4。

由表4可見，記錄數(shù)據(jù)經(jīng)分析后得，孢子萌發(fā)率：淀粉>葡萄糖>乳糖>蔗糖>麥芽糖，其中淀粉處理萌發(fā)率最高，為60.97%。淀粉、葡萄糖、乳糖處理差異不顯著，所以孢子萌發(fā)適宜碳源為葡萄糖、乳糖，最適碳源為淀粉。

由表5可見，在各種氮源的培養(yǎng)液中，孢子均能萌發(fā)，尤以硝酸鈣為氮源的處理孢子萌發(fā)率最高。且硝酸鈣與氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、尿素、谷氨酸處理間有顯著性差異。因此硝酸銨為最適氮源。