離體蛙心灌流實驗方法改進實驗教學應用
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摘要：離體蛙心灌流實驗是功能學科經(jīng)典實驗之一。文章通過選擇合適的實驗動物，制作了一種新型簡便實用的蛙心插管，提出的改進插管方法等措施提高了離體蛙心灌流實驗的成功率。目前該方法運用到實驗教學中，收到良好教學效果。
某些因素和藥物對離體蛙心活動的影響實驗是功能學科實驗教學的重要內(nèi)容之一，心臟具有自動節(jié)律性，作為蛙心起搏點的靜脈竇能按一定節(jié)律自動產(chǎn)生興奮。離體蛙心在任氏液灌流的情況下可以比較持久地維持其生理特性。人為地改變?nèi)问弦旱碾x子成分，或者加入某些藥物能顯著地影響心臟的活動[1]。該實驗中，離體蛙心的制備對實驗人員的操作手法要求很高，涉及動脈插管、離體器官的灌流等技術，操作難度大，對于教學實驗來說，在有效的時間內(nèi)提高離體蛙心灌流實驗的成功率尤為重要。復旦大學功能學科教學實驗室在多年的實踐和探索中分析了實驗失敗的原因并提出了改進措施。
1實驗準備
1.1實驗動物的選擇
傳統(tǒng)的實驗選用蟾蜍作為實驗動物，但是蟾蜍屬于“三有”保護動物，即國家保護的有益的或有重要經(jīng)濟、科學研究價值的陸生野生動物。牛蛙屬于兩棲綱動物，是一種大型的食用蛙，超市以及市場購買方便。目前實驗室用牛蛙替代原有的實驗動物[2-4]。
1.2新型蛙心插管的制作
蛙心插管由一次性注射器和頭皮針加工改制，將一次性注射器活塞拔出不用，頭皮針根據(jù)需要保留連接注射器的頭和適當長度的塑料管，將剩余針頭和大部分塑料管剪去。將上述二者連接，即為蛙心插管。一次性注射器方便易得，且管壁上印有刻度，容易控制灌流液的體積，不同型號注射器可適用不同大小的蛙類心臟。頭皮針剪下的軟管通常適用于牛蛙較大的心臟離體灌流，使用過程中根據(jù)習慣，可以通過紫外燈照射、清水浸泡等方式改變其軟硬度和韌性，如需用于較小的蛙類心臟，管徑可通過加熱后拉細。頭皮針連接注射器的頭部旁邊有2片塑料突起，可以用于固定結(jié)扎線，插管成功后容易固定。如有條件，可選擇帶有注射器標準接口的其他臨床用質(zhì)地稍硬管材代替頭皮針，效果更佳。解決了原玻璃蛙心插管燒制復雜、易碎、固定后易滑脫的缺點[5]。
1.3制備離體蛙心
傳統(tǒng)的插管方法在插管前用絲線分別結(jié)扎右主動脈、左右肺靜脈、前后腔靜脈[1]。插管前，阻斷心臟的血流，使心臟短時間內(nèi)停止收縮射血，血液聚集于心腔，使心臟過度膨大，妨礙蛙心插管并影響心肌活性[6-7]。在腔靜脈結(jié)扎時，學生容易誤將腔靜脈與靜脈竇一起結(jié)扎，導致心臟停跳。改進后的實驗方法在插管前結(jié)扎左主動脈，不結(jié)扎右主動脈和腔靜脈，避免誤扎靜脈竇，蛙心保持血液循環(huán)，蛙心收縮強有力。在右主動脈下穿一絲線，打一松結(jié)，用眼科剪在右主動脈向心剪一小斜口，讓心腔內(nèi)的血盡可能流出，把裝有0.4%肝素任氏液的蛙心插管插入右主動脈，經(jīng)主動脈瓣插入心室腔內(nèi)，血液會立即隨心室搏動涌入插管。將預先打好的松節(jié)扎緊，并將線固定在插管塑料突起片上。用滴管吸去插管中的液體，更換新鮮任氏液降低肝素對心肌活動可能存在的影響，小心提起插管和心臟，剪去血管和牽連組織，將心臟取出。蛙心夾應在心室舒張期一次性夾住心尖，避免夾傷心臟。既不能夾住大部分心室影響心臟收縮，也不能只夾一點心尖部，容易脫落并且損傷心臟導致漏液。連接裝置后，換能器的連線應與插管中軸在同一直線上，即與地面垂直。最后將離體心臟固定在支架上，通過夾住心尖的蛙心夾及其連線，將心臟的舒縮活動所產(chǎn)生的張力變化傳遞給張力換能器。配合生物信號采集系統(tǒng)觀察相關指標。
2蛙心插管成功率的影響因素與改進措施
2.1蛙心插管操作不當致使心臟受損
蛙心插管經(jīng)動脈逆血流方向插入心室，插管前端不應過于鋒利，否則容易引起心臟瓣膜或者心肌受損，從而導致心律失常，實驗失敗[8]。原有的玻璃插管比新制作的插管鋒利、材質(zhì)更硬，操作不當容易使心臟受損。新制作的蛙心插管可以根據(jù)實驗需求制作出適宜軟硬、管徑、長度、鋒利程度的插管頭端配合適宜體積的插管管體使用。軟硬適中的插管可以調(diào)節(jié)方向順勢插入心室，插管材質(zhì)柔和避免心臟受損。
2.2蛙心插管前端血液容易凝固
裝有任氏液的蛙心插管插入心室腔內(nèi)，血液會立即隨心室搏動涌入插管并及時更換管內(nèi)任氏液。但如果插管不順，操作時間過長，未能及時將蛙心插管和蛙心內(nèi)的血液沖洗干凈，血液容易凝固堵塞插管尖端，即使插管插入心室但無法灌流[9]。實驗方法改進后，插管時先將插管內(nèi)注入少量0.4%肝素任氏液避免血液堵塞插管[10]。
2.3插管切口位置的選擇
傳統(tǒng)的插管方法把裝有任氏液的蛙心插管插入左主動脈，插至主動脈球后稍稍退出再將插管沿主動脈球后壁向心室中央方向插入，經(jīng)主動脈瓣插入心室腔內(nèi)。插管切口位置距動脈圓錐不應過于靠近，插入過深插管容易刺破心室壁，插管過淺容易從心室內(nèi)滑脫，均影響實驗效果。有研究指出，從左主動脈插管，管尖直接面對動脈圓錐的外側(cè)壁，此處壁薄且沒有貼敷組織導致蛙心插管向相反方向移動，妨礙插管的進行，而且學生操作時插管堵在圓錐處，很難調(diào)整角度繼續(xù)插管，反復拔插或者擠壓心臟，損傷瓣膜或者心肌。管尖經(jīng)右主動脈插管，插管面對的是動脈圓錐的內(nèi)側(cè)壁或者半月瓣，插管不會移動不需要轉(zhuǎn)角度，便于插管，插入后心臟外形不會變形，不會引起動脈圓錐處的外凸[9,11]。傳統(tǒng)方法由于右主動脈比左主動脈細操作困難而放棄從右主動脈插入。實驗動物改進后，牛蛙的右主動脈比較粗，不影響實際操作，待心室收縮半月瓣打開時，將插管順勢插入心室腔內(nèi)。
2.4控制灌流液的溫度和體積
環(huán)境溫度對離體心臟的收縮活動有影響，我校課程一般安排在10月份，實驗時可以將灌流液水浴加熱到20℃左右再進行實驗，以保持心臟活性。插管內(nèi)灌流液液面高壓力大的情況下，心室舒張時會有更多灌流液流入心室，導致心室舒張時因液壓高阻礙心室液體泵出，持續(xù)時間過長會導致心室失去收縮能力[12]。新插管的管體帶有刻度，更換灌流液時需要保持前后液面高度的一致，否則會影響實驗結(jié)果。離體蛙心灌流裝置如圖1所示。
3教學效果
對于教學實驗而言，初次嘗試蛙心插管失敗率高，時間條件不允許學生有多次練手的機會。反復插管不進易導致心臟受損實驗失敗。將上課學生隨機分成傳統(tǒng)方法組和改進方法組，各24組。計量資料以（均數(shù)±標準差）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。實驗動物更換之后，在實際教學中，某些因素及藥物對離體蛙心活動的影響的實驗結(jié)果相比較之前無差異性。實驗方法改進后，減少了插管步驟，縮短了插管時間，降低了凝血率，提高了插管成功率（見表1）。
4結(jié)語
離體蛙心灌流實驗廣泛應用于醫(yī)學、生物學、藥學等教學和科學研究中。蛙心插管是離體蛙心灌流實驗的關鍵。離體蛙心灌流實驗作為功能學科經(jīng)典實驗之一，需要學生掌握。本研究的實驗動物為牛蛙，制作了價格低廉、使用方便的蛙心插管，建立了一種較為完善可靠的插管方法，運用于教學實驗中，提高了實驗成功率，學生滿意度高，對相關科學研究具有參考價值。
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作者：王見之 張亞東 嚴鈺鋒 單位：復旦大學