臨床醫(yī)學(xué)流式細(xì)胞術(shù)研究

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摘要：流式細(xì)胞術(shù)是能在分子水平上對(duì)細(xì)胞內(nèi)外因子進(jìn)行快速定性和定量研究的一種細(xì)胞分析和檢測(cè)的手段，是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。是近代細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)和單克隆技術(shù)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)等學(xué)科高度發(fā)展的結(jié)晶。其具有測(cè)量指標(biāo)多、采集數(shù)量大、可高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，而且可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣本中的多個(gè)被測(cè)因子，可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展取得了顯著的成果，其應(yīng)用領(lǐng)域和使用范圍也在不斷擴(kuò)大。本文對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的工作原理和流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的概述，并對(duì)其在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)菌學(xué)、中醫(yī)學(xué)等方面進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞術(shù)；臨床醫(yī)學(xué)；應(yīng)用

近年來(lái)，隨著單克隆抗體的應(yīng)用及流式細(xì)胞術(shù)的快速發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）已成為許多疾病診斷和分性的重要依據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)70年展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，它作為一門(mén)生物檢測(cè)技術(shù)集計(jì)算機(jī)技術(shù)、測(cè)量技術(shù)、激光技術(shù)、流體動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體，是對(duì)快速直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞、生物顆粒或液體中的大分子物質(zhì)進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的一種技術(shù)［1］。1973年美國(guó)BD公司推出全國(guó)第一臺(tái)流式細(xì)胞儀，通過(guò)對(duì)流動(dòng)液體中排列成單列細(xì)胞或顆粒進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)得到該細(xì)胞或顆粒的光散射和熒光指標(biāo)，分析它們的體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)性質(zhì)，還能對(duì)所需要的細(xì)胞進(jìn)行分選等。具有檢測(cè)速度快、測(cè)量指標(biāo)多、采集數(shù)量大，對(duì)所需的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行分析或分選等特點(diǎn)［2］，其在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、遺傳免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等眾多研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

1流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)及工作原理

1．1流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)

主要由五部分組成：（1）流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；（2）激光光源及光束形成系統(tǒng)；（3）光學(xué)系統(tǒng)；（4）信號(hào)檢測(cè)與儲(chǔ)存、顯示、分析系統(tǒng)；（5）細(xì)胞分選系統(tǒng)。

1．2流式細(xì)胞儀的工作原理

將待測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液，用一定壓力將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，不含細(xì)胞的硫酸緩沖液在高壓下從鞘液管?chē)姵?，鞘液管入口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣鞘液就能夠包繞樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包繞下單行排列，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域。流式細(xì)胞儀通常以激光作為光源，經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收，光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大?。粺晒庑盘?hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過(guò)模／數(shù)轉(zhuǎn)換器將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)將這些數(shù)字信號(hào)收集、儲(chǔ)存，以一維直方圖或二維點(diǎn)陣圖及數(shù)據(jù)表或三維圖形顯示出來(lái)，可以用不同的標(biāo)記物進(jìn)行雙參數(shù)、三參數(shù)甚至多參數(shù)的分析［3，4］。

2流式細(xì)胞儀的技術(shù)指標(biāo)

包括：（1）分析速度：很高可以達(dá)到5000個(gè)／s左右，大型的流式細(xì)胞儀的分析速度可達(dá)10000個(gè)／s；（2）熒光檢測(cè)靈敏度：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞上的熒光分子＜600個(gè)，或兩個(gè)細(xì)胞之間的熒光差＞5％就能區(qū)分；（3）前向角散射光檢測(cè)靈敏度：一般的可以檢測(cè)到的最小顆粒直徑在0．2～0．5μm；（4）分辨率（CV）：一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到＜2．0％；（5）分選速度：一般流式細(xì)胞儀分選速度＞100個(gè)／s，分選細(xì)胞純度可達(dá)99％［5］。

3流式細(xì)胞術(shù)在臨床中的應(yīng)用

3．1在血液學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)對(duì)外周血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA的檢測(cè)分析對(duì)各種血液病如白血病、淋巴瘤等血液系統(tǒng)疾病的分型、診斷、治療及預(yù)后判斷均有重要作用。血細(xì)胞在白細(xì)胞系、紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系、血小板及非造血細(xì)胞均有不同的分化抗原表達(dá)，分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中。血液腫瘤細(xì)胞的特征是喪失了正常細(xì)胞的系類(lèi)專(zhuān)一性和分化階段的規(guī)律性，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)將具有系列特異性并涵蓋不同分化階段的單克隆體作為分子探針來(lái)檢測(cè)血液腫瘤細(xì)胞的內(nèi)外抗原，可以反映其本質(zhì)上與正常造血細(xì)胞的差異［6］。流式細(xì)胞術(shù)采用各種抗血細(xì)胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料（異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等）測(cè)定一個(gè)細(xì)胞的多種參數(shù)，以正確判斷出該細(xì)胞的屬性。流式細(xì)胞術(shù)還可以應(yīng)用在白血病免疫分型方面，目前國(guó)內(nèi)外均主張采用FCMCD45／SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)計(jì)方法進(jìn)行白血病免疫分析。采用此法可將骨髓細(xì)胞清晰地分成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞、幼稚細(xì)胞和有核紅細(xì)胞群，這樣可以排除正常細(xì)胞對(duì)免疫分型的干擾，從而提高免疫分析的準(zhǔn)確性，而且測(cè)量細(xì)胞一般在1～5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，快速特異、準(zhǔn)確性好，并且能夠提供正常細(xì)胞在演變成惡性腫瘤過(guò)程細(xì)胞基因及抗原標(biāo)志發(fā)生變化的信息。而這種細(xì)胞的變化是常規(guī)FAB法所不能分辨的。這種分型對(duì)于治療方案的正確選擇與預(yù)后有著重要的意義同時(shí)也提供了可靠的依據(jù)［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在臨床血液病檢測(cè)和診斷中診斷準(zhǔn)確率高達(dá)90％以上，與普通檢測(cè)法相比準(zhǔn)確率提高達(dá)20％［8］。流式細(xì)胞術(shù)可以通過(guò)某些熒光染料與紅細(xì)胞中的RNA結(jié)合，定量地測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞中的RNA，得到網(wǎng)織紅細(xì)胞占成熟紅細(xì)胞的百分比，從而準(zhǔn)確地反映骨髓造血功能。有作者報(bào)道FCM方法比目測(cè)法結(jié)果精確度更高［9］。此外FCM還可以測(cè)出網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟度，對(duì)紅細(xì)胞增值能力的判斷很有意義，為干細(xì)胞移植術(shù)后恢復(fù)的判斷、貧血的治療監(jiān)測(cè)、腫瘤患者放化療對(duì)骨髓的抑制狀況等提供依據(jù)。

3．2在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用主要是對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA含量進(jìn)行測(cè)定，包括癌前病變及早期癌變的檢出，輔助腫瘤的早期診斷和鑒別診斷。不僅如此，還可以根據(jù)化療過(guò)程中腫瘤DNA分布直方圖的變化評(píng)估療效，了解細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的變化。臨床醫(yī)生可根據(jù)各細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，結(jié)合化療藥物對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的干擾理論，設(shè)計(jì)最佳治療方案，再依照DNA直方圖直接地看到腫瘤細(xì)胞的殺傷變化，及時(shí)調(diào)整治療方案，選取有效藥物以使對(duì)腫瘤細(xì)胞達(dá)到最大的殺傷效果［10］。

3．3在免疫學(xué)中的應(yīng)用

利用抗原抗體特異性反應(yīng)的原理將流式細(xì)胞儀與單克隆抗體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原、癌基因蛋白及膜受體進(jìn)行定量檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于臨床，對(duì)人體細(xì)胞免疫功能的評(píng)估具有重要的意義。流式細(xì)胞術(shù)可進(jìn)行T、B和NK淋巴細(xì)胞水平的分析，還可以進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群的分析，區(qū)分不同的淋巴細(xì)胞亞群，計(jì)算其相互間的比例，進(jìn)而了解淋巴細(xì)胞的分化功能。更重要的是，通過(guò)研究大多數(shù)疾病的特異性淋巴細(xì)胞亞群，對(duì)一些疾病如免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等的診斷、治療、免疫功能的重建具有重要的指導(dǎo)意義。例如CD4是輔助性淋巴細(xì)胞，它是遲發(fā)性超敏反應(yīng)的啟動(dòng)者，是促使B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的輔助性細(xì)胞，也是抑制性T細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞，而CD8是抑制性T細(xì)胞，是細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，是抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的抑制性細(xì)胞［11］。在許多免疫性疾病中，淋巴細(xì)胞亞群的增多與減少對(duì)疾病的發(fā)展具有重要的作用。如在先天性發(fā)育不良綜合征中FCM分析顯示外周血CD3TCD4＋和CD8＋T細(xì)胞均減少，在殘余T細(xì)胞中T細(xì)胞受體（TCR）αβ分子表達(dá)減少，γδ分子表達(dá)正常，CD4＋／CD8＋T細(xì)胞比例升高，隨著受累者年齡的增加CD8＋細(xì)胞數(shù)增多，而有些患者T細(xì)胞數(shù)量增加，最終可達(dá)正常［12］。流式細(xì)胞術(shù)還可以進(jìn)行HLA群體分析，在強(qiáng)直性脊柱炎患者中用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA－B27抗原陽(yáng)性率高達(dá)92．6％，而且可以排除交叉反應(yīng)，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性［13］。

3．4在中醫(yī)藥研究方面的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)可用于單味中藥有效成分的作用效果測(cè)定分析。如研究復(fù)方苦參方劑對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞體外增值凋亡的影響中，分析DNA含量及細(xì)胞周期，結(jié)果顯示Lo－Vo細(xì)胞可檢測(cè)亞G1峰，凋亡率于對(duì)照組相對(duì)比例增高，細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)S期阻滯現(xiàn)象，表明復(fù)方苦參方劑具有一定的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用［14］。在慢性阻塞性肺疾病的肺氣虛證、肺陰虛證患者中CD4＋、CD4＋／CD8＋均降低，CD8＋升高，說(shuō)明肺氣虛證與肺陰虛證患者均存在細(xì)胞免疫功能低下［15］。

3．5在細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)具有快速、靈敏、精確并能進(jìn)行多參數(shù)分析的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的診斷和藥敏實(shí)驗(yàn)，是研究細(xì)菌異質(zhì)性、細(xì)菌抗生素后效應(yīng)、多種病原菌混合感染等的有效方法。常用的為流式細(xì)胞術(shù)藥敏試驗(yàn)：檢測(cè)不同細(xì)菌時(shí)，根據(jù)藥物對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)理選擇合適的熒光染料，通過(guò)細(xì)菌總體平均熒光強(qiáng)度束反映抗生素對(duì)細(xì)菌的抗菌活性，3h左右即可得出檢測(cè)結(jié)果，尤其適用于急需藥敏報(bào)告的重癥感染病菌的檢測(cè)。

3．6在血小板疾病診斷中的作用

血小板是止血機(jī)制中一個(gè)重要因素，其表面含有多種糖蛋白及各種受體，這些受體與相應(yīng)的配體相結(jié)合后，血小板被激活，并發(fā)生形態(tài)變化，血小板聚集和顆粒釋放等一系列反應(yīng)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板標(biāo)志物在許多血小板相關(guān)疾病的診斷上具有重要的臨床價(jià)值［16］。如GPⅠb／Ⅸ復(fù)合物先天缺陷導(dǎo)致巨大血小板綜合征；GPⅡb／Ⅲa復(fù)合物先天缺陷導(dǎo)致血小板無(wú)力癥［17］。在免疫性血小板減少性紫癜的患者中，F(xiàn)CM可以測(cè)定患者血液中的PAIgG、PAIgM、PAIgA，熒光陽(yáng)性百分率的診斷效率為45．8％，平均熒光強(qiáng)度的診斷效率為72．5％，兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合的診斷效率為74．2％［18］；因此FCM檢測(cè)血小板抗體可用于免疫性血小板減少性紫癜的診斷及治療監(jiān)測(cè)。用FCM內(nèi)參定位法定量分析血小板微粒在血栓性疾病和血栓前狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展中的作用，有利于血栓性疾病的診斷和治療。

3．7在精子相關(guān)疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

精子質(zhì)量檢測(cè)是診斷男性不育癥的重要手段，由于檢測(cè)精子數(shù)低及主觀因素的影響，常規(guī)的精液檢查只能反映精子的形態(tài)特征和有限的功能，不能為生育能力提供準(zhǔn)確評(píng)估的依據(jù)，用FCM檢查精液可把定性的描述變成定量的研究，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，可對(duì)精液進(jìn)行高通量、多參數(shù)分析，得到不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)據(jù)及精子形態(tài)指標(biāo)，對(duì)臨床診斷精子發(fā)生障礙的性質(zhì)、原因和程度提高了客觀依據(jù)，可對(duì)少、弱精子和無(wú)精子癥的判斷、治療及療效的觀察作出正確的評(píng)價(jià)，為客觀評(píng)價(jià)男性生育能力提供了有力的依據(jù)。用FCM檢測(cè)生精細(xì)胞凋亡情況是迅速、準(zhǔn)確、客觀、可靠地評(píng)估精子功能和男性生育力的新方法［19］。

3．8在器官移植中的作用

可用流式細(xì)胞術(shù)判斷供者與受者之間的配型是否合適。檢測(cè)受者血清中抗供者的抗HLA抗體，如果受者血清中存在針對(duì)供者的循環(huán)抗體，就會(huì)同供者的淋巴細(xì)胞結(jié)合，在加入熒光素的二抗來(lái)顯示這種結(jié)合，就可在移植前后發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)抗體，以判斷供者與受者之間是否合適。移植后的免疫表型監(jiān)測(cè)也很重要，移植后的CD4／CD8比值低下的患者排斥反應(yīng)發(fā)生較多，受者血清中產(chǎn)生抗供體細(xì)胞抗體預(yù)后較差，應(yīng)及時(shí)監(jiān)測(cè)以便進(jìn)行抗排斥的預(yù)防和治療［4］。綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)是一種在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)、臨床及科學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用前景的細(xì)胞分析技術(shù)。它具有分辨率高、分辨細(xì)胞數(shù)量大、參數(shù)多、準(zhǔn)確性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)。隨著流式細(xì)胞分析技術(shù)與方法的迅速發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)在臨床的應(yīng)用范圍也不斷拓展，并將成為推動(dòng)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要手段。

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作者：李素芝 單位：天津市安寧醫(yī)院