細胞生物學特性精選(九篇)
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第1篇：細胞生物學特性范文
【關(guān)鍵詞】干細胞； NF-κB抑制因子α；細胞增殖；細胞分化；細胞因子
Effect of mutated IκBα gene on the biological characteristics of immortalized neural progenitor cell strain
ZHU Chang， LIU Zhi-heng， ZHANG Chuan-han， et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College， Huazhong University of Science & Technology， Wuhan 430030， China
【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IκBα gene on the proliferation，differentiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs， MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index. Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was slowed down in mutated IκBα gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF-α between mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1β and IL-6 was reduced in mutated IκBα gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IκBα gene can slow down the proliferation of INPCs， reduce the expression of some cytokines， but didn’t influence the differentiation of INPCs.
【Key words】Stem cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines
本實驗室成功構(gòu)建了SV40Tag永生化的大鼠神經(jīng)前體細胞株（INPCs）[1]，并在此基礎上構(gòu)建了轉(zhuǎn)IκBα突變型基因永生化神經(jīng)前體細胞株。作為細胞移植治療的細胞來源和外源基因的載體，INPCs的生物學特性在轉(zhuǎn)入外源基因后有何改變，是進一步研究首先應關(guān)注的問題。本研究擬通過比較轉(zhuǎn)IκBα突變型基因及空白對照載體的INPCs在增殖、分化以及細胞因子分泌功能上的差異，為進一步將該轉(zhuǎn)基因細胞用于細胞移植治療腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎。
材料與方法
材料 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本實驗室構(gòu)建，DMEM/F12培養(yǎng)基、B27無血清培養(yǎng)添加劑（Gibco公司，美國）；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)（Pepro Tech公司，英國）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美國）；抗β-actin抗體、抗膠原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、抗微管相關(guān)蛋白2（MAP2）抗體（Neomarkers公司，美國）； Trizol試劑（上海華舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。
細胞培養(yǎng)及傳代 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1或pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25％胰酶消化傳代。
細胞生長曲線的繪制 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以每孔5×103的密度接種于96孔板，共種8板，每板每株細胞接種12孔，每24h取出一板，每孔加入0.2％MTT 50μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10 min，在酶標儀（Bio-Rad公司，美國）上測定570nm吸光度值，并繪制生長曲線。
細胞增殖指數(shù)的測定 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs分別制成單細胞懸液，PBS 洗一次后，加入-20 ℃預冷的80 %乙醇固定， 冰浴30min，固定后的細胞用PBS 洗滌2 次，調(diào)整細胞濃度為1 ×106 / ml，加入PI (終濃度為50μg/mL)和RNA酶（終濃度為1μg/ml）， 室溫避光孵育1h后上機檢測，細胞增殖指數(shù)= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。
Western blot檢測細胞分化 分別提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細胞總蛋白，兩株細胞以5％血清誘導分化一周后分別提取總蛋白，以β-actin為內(nèi)參照，取等量的蛋白質(zhì)經(jīng)10%聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上， 用5%脫脂奶粉封閉1h，加10μg/ml抗GFAP單抗、抗MAP2單抗或抗β-actin單抗，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，漂洗后二氨基聯(lián)苯胺顯色2～3 min，水洗后照相。
Realtime RT-PCR 檢測細胞因子的表達 用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的總mRNA，8453E型紫外分光光度儀（Agilent公司，美國）測定RNA濃度，參照SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒說明操作，用等量的總mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板在LightCycler real-time PCR儀（羅氏公司，美國）上進行PCR反應，反應條件為：94℃預變性10 s，94℃變性5 s，60℃退火及延伸20s，共反應40個循環(huán)后，分析融解曲線，參照Livak等人的方法，以2－σσCT法分析細胞因子的的相對表達量[2]，引物列表見表1。
統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12. 0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（ ±s）表示，不同細胞株間比較采用成組t檢驗，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。
結(jié) 果
生長曲線的繪制 采用MTT法繪制的轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的生長曲線，見圖1。除接種后第一天外，各時點轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均較相同時點轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs低，同時點兩株細胞間比較，差異有統(tǒng)計學意義。
流式細胞儀檢測細胞增殖指數(shù) 轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細胞增殖指數(shù)依次為61.64％±4.25％和46.19％±0.86％，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義。
Western blot檢測細胞分化 血清誘導分化后，兩株細胞MAP2的蛋白條帶極其微弱，GFAP條帶明顯，誘導分化前，轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs均有明顯的MAP2條帶，而無明顯的GFAP條帶，兩株細胞間比較，MAP2和GFAP條帶的明暗程度在分化前及分化后無明顯差異。（見圖2）
細胞因子的表達 用Realtime RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs細胞因子mRNA的相對表達量，如表2所示。將轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs相應細胞因子的表達量定義為1，兩株細胞TNF-α的mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs中IL-6 及IL-1β mRNA的表達較轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs低，差異有統(tǒng)計學意義。
討 論
神經(jīng)前體細胞具有不斷分裂增殖、自我更新以及多分化潛能[3]。轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的培養(yǎng)和傳代證實，轉(zhuǎn)入IκBα突變型基因后，INPCs仍能不斷分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通過半定量的方式證實，轉(zhuǎn)入的外源基因并未影響INPCs的分化特性，即血清誘導分化后大部分細胞表達作為星形膠質(zhì)細胞標志的GFAP，分化為星形膠質(zhì)細胞，僅有少量細胞表達作為神經(jīng)元標志的MAP2，分化為神經(jīng)元。增殖和分化潛能的保持即證實了轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs保持了神經(jīng)前體細胞的特性，同時也是該細胞株用于細胞移植治療的基本保證。
第2篇：細胞生物學特性范文
【摘要】目的：觀察阿霉素長時間作用對膽管癌細胞株FRH0201生物學活性的影響。方法：用2μg/ml的阿霉素同一濃度逐漸延長時間作用于人膽管癌細胞株FRH0201細胞，經(jīng)反復作用篩選出能在含1μg/ml的阿霉素培養(yǎng)液中生存72h，去掉阿霉素后仍能繼續(xù)穩(wěn)定傳代生長的細胞。無藥培養(yǎng)1月后進行生物學行為的監(jiān)測。觀察細胞形態(tài)學，繪制生長曲線和流式細胞儀測定細胞周期，酶聯(lián)免疫吸附法測定細胞的腫瘤標記物，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)的阿霉素的熒光強度。結(jié)果：阿霉素作用后FRH0201細胞形態(tài)學有輕度改變，細胞倍增時間較親本細胞延長3h，與親本細胞相比S期細胞增多16.89%，G1期細胞減少29.33%、G2期細胞增多12.46%。CA125和CA199試驗組和親本組分別為9.14和8.60U/ml，1.59和2.96U/ml，細胞內(nèi)阿霉素濃度（熒光強度平均值），親本細胞為1764.8，試驗組細胞為305.4。結(jié)論：阿霉素對膽管癌細胞株FRH0201的形態(tài)學及倍增時間無明顯影響，但使細胞進入S期、G2期的增多，細胞內(nèi)藥物濃度明顯降低，生長時間無明顯變化。
【關(guān)鍵詞】膽道腫瘤・阿霉素・腫瘤細胞，培養(yǎng)液・細胞周期・細胞大小・CA125・CA199
TheeffectsofadramycinonthehumanliverhilarcholangiocarcinonacelllineFRH0201
【ABSTRACT】Objective:ToinvestigatetheeffectsofadramycinoncelllineofFRH0201.Methods:Humanhilarcholangiocarcinonacelllinewereculturedwithadramycin(2μg/ml)throughlastingdifferenttimes,finallythiscelllinecansurviveafter72hculturedinthecultureliquidwiththeadramycin(1μg/ml).Thenthemediumwasreplacedwithafreshonewithoutadramycin,andthecellswerecontinuouslyculturedfor1month.Theinvitrostudiesincludedtheobservationoftheappearancewithopticalmicroscope,MTTcellproliferationassay,analysisofthecellcyclebyFlowcytometry(FACS),assaysoftumormarkerusingenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA),thefluorescencedensityofadramycin.Results:ComparedtotheparentFRH0201cellline:Themorphologyshowedtypicalmorphologicalcharacteristics,thedoublingtimeprolongedabout3h,thecellcyclebyflowcytometryidentifiedinG1,G2andSphaseofcellcyclewere40.50%,19.74%and39.77%intrialgroup,and69.83%,7.29%and22.88%inparentgroup,respectively.Tumormarkerhasnodifferencebetweenthem,thefluorescencedensityofepirubicindescending5.2times.Conclusion:Theadramycincanaffectthecellcycleandcausethechangeofmetabolism.
【KEYWORDS】Biliarytractneoplasms・Adramycin・Tumorcells,cultured・Cellcycle・Cellsize・CA125・CA199
目前，肝門部膽管癌手術(shù)切除率已明顯提高，手術(shù)病死率明顯下降，但真正達到根治性切除的病例很少，局部復發(fā)率很高，現(xiàn)有的化療及放療未見明顯的效果。其原因可能與肝門部膽管癌的生物學特性有關(guān)［1］。為此，我們觀察阿霉素長時間作用對膽管癌細胞株FRH0201生物學活性的影響。
1材料和方法
1.1材料阿霉素購于深圳萬樂公司，MTT購自愛博生物工程有限公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。膽管癌細胞株FRH0201由本課題組吳小鵬教授構(gòu)建［2］。
1.2方法采用濃度相同不斷增加作用時間的方法確定阿霉素培養(yǎng)液終濃度為1μg/ml。首先分別向FRH0201細胞株的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入不同濃度的阿霉素（Adramycin,ADR），培養(yǎng)3d后觀察細胞死亡情況。結(jié)合阿霉素的血漿濃度，選擇可將50%的細胞抑制的藥物濃度（IC50）作為耐藥細胞培養(yǎng)的起始濃度（2μg/ml），將腫瘤細胞置于該培養(yǎng)液中和不含藥物的10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞穩(wěn)定生長、進入對數(shù)生長期后，傳代兩次，再將篩選出的細胞在相同藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過1，2，3，6，12，24，36，48，60，72h10個時間段約8個月的培養(yǎng)，最終使細胞能夠在1μg/ml阿霉素培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個月在檢測細胞的生物特性。
>1.3觀察指標
1.3.1形態(tài)學觀察將兩株細胞分別爬片后經(jīng)HE染色，光鏡下進行形態(tài)學觀察。
1.3.2細胞倍增時間的測定取對數(shù)生長期的親本細胞即未用藥的細胞和阿霉素作用的細胞與試驗組細胞各一瓶，0.25%胰蛋白酶消化，10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104個/ml的單細胞懸液，96孔板中每孔接種200μ1，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每天取3個復孔計數(shù)活細胞，計算平均值，連續(xù)觀察7d。以培養(yǎng)時間為橫軸，以細胞數(shù)的對數(shù)為縱軸，繪制半對數(shù)細胞生長曲線，于生長曲線上對數(shù)生長期內(nèi)取3組數(shù)據(jù)，根據(jù)最小二乘法進行直線回歸，在直線上任取兩點（Nt、No），根據(jù)下列公式計算細胞的倍增時間(Td）［3］。T代表No~Nt的時間Td=T×Ig2/Ig(Nt/No）
1.3.3細胞周期分析取對數(shù)生長期的親本及實驗組細胞各1×106個/ml，制成單細胞懸液，按試劑盒說明進行操作，于流式細胞儀（FCM）上行細胞周期分析。
1.3.4腫瘤標記物CA125、CA199分別將同等數(shù)量的親本及試驗組細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細胞進入對數(shù)生長期后，分別收集培養(yǎng)液各10ml，1000r/min離心5min后取上清，用酶聯(lián)免疫吸附法進行CA125及CA199的檢測。
1.3.5激光共聚焦顯微鏡檢測將親本細胞與試驗組細胞制備單層細胞爬片。將載玻片置于培養(yǎng)皿中10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104個/ml的單細胞懸液，待細胞貼壁生長均勻布滿載玻片后加入2μg/ml阿霉素作用30min，PBS洗滌細胞2次，在磁共振共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強度表示。然后計算平均值。
2結(jié)果
2.1形態(tài)學改變倒置顯微鏡下對數(shù)生長期的FRH0201細胞呈鋪路石狀鑲嵌緊密排列，細胞呈多邊形、梭形、圓形、不規(guī)則形、三角形等各種形態(tài)，生長活躍，細胞體積變大，折光性差，核漿比例變大，細胞核增大。有多核細胞，有異常核分裂相。
2.2細胞倍增時間實驗組細胞倍增時間為23.6h，延長了約3h。
2.3細胞周期分析實驗組細胞與親本細胞相比：S期細胞增多16.89%，G1期細胞減少29.33%、G2期細胞增多12.46%。見圖1、2。
2.5激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強度表示，計算平均值。見圖3。
3討論
肝門膽管癌及膽囊癌術(shù)后化療是重要的輔助治療手段，但化療的敏感性不高。且可能存在個體性差異及可能誘發(fā)的腫瘤多藥耐藥性。為了臨床及基礎方面對膽道惡性腫瘤綜合治療的研究，F(xiàn)RH0201細胞代表原發(fā)灶的所有細胞群體［2］，并已成功建立裸鼠動物模型［3、4］，我們用阿霉素對該細胞株進行干預，觀察對其生物學特性的影響。為了更接近臨床膽管癌化療反復間歇用藥的特點，對FRH0201細胞采用大劑量反復間歇同一濃度不同時間暴露，歷時8個月，獲得了穩(wěn)定生長的細胞。本次試驗不同于其它耐藥株固定藥物濃度，這更符合臨床用藥方式。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)在低氧時，腫瘤細胞在含有阿霉素的培養(yǎng)基中可以繼續(xù)生長繁殖，一旦更換培養(yǎng)基后同樣劑量的藥物，細胞雖然可以繼續(xù)貼壁伸展。但藥物持續(xù)存在時卻出現(xiàn)凋亡細胞，隨著作用時間的延長，凋亡細胞逐漸減少。該細胞生物學特性的研究將為下一步耐藥株的建立，探討膽管癌耐藥機理及逆轉(zhuǎn)耐藥奠定基礎。以往研究發(fā)現(xiàn)，與親本細胞株比較，耐藥細胞株在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及代謝水平等方面均發(fā)生了顯著變化［5］。本實驗細胞在無藥培養(yǎng)1個月后生長穩(wěn)定，倍增時間稍有延長，其分泌的腫瘤標記物如CA125、CA199較親本細胞有所降低，這可能與藥物抑制細胞活性有關(guān)，也可能是藥物導致了細胞的分化有關(guān)，但是細胞排泄毒性藥物的作用得到了增強。我們推測這些生物學性狀的改變與其耐藥表型密切相關(guān)，但其詳細機理尚有待進一步研究。經(jīng)流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，藥物處理前后試驗組G1期細胞比親本組約減少29.33%，G2期細胞比親本組增加12.46%，S期細胞增多16.89%，說明細胞通過細胞周期限制從G1期進入S期，然后阻滯于G2期，G2期的主要特征是RNA的合成和染色質(zhì)的螺旋化，此期對外界環(huán)境敏感，易受各種因素的影響［6］。提示根據(jù)藥物對膽管癌細胞周期各期的影響，在臨床上可以更好地選擇不同的化療藥物，聯(lián)合用藥以增加療效，減少副作用。在經(jīng)藥物作用篩選后1月，細胞內(nèi)抗腫瘤藥物濃度仍明顯降低，證明了細胞穩(wěn)定表達了某種機制，該機制可以使腫瘤細胞耐受阿霉素的殺傷作用，但具體的機制需要進一步證實。本實驗提示：（1）通過適當劑量的間歇的持續(xù)的沖擊應用抗腫瘤藥物，可以篩選出持續(xù)生長的細胞；（2）膽管癌細胞在阿霉素作用下，細胞內(nèi)的抗腫瘤藥濃度下降，這是腫瘤細胞在含抗腫瘤藥物的掊養(yǎng)液中生長繁殖的基礎；（3）阿霉素可以影響細胞的分裂增殖周期。但該結(jié)論尚需今后進一步實驗得以證實。
參考文獻
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［5］Uchiyam
第3篇：細胞生物學特性范文
Biological characteristics of placentaderived adherent cells
【Abstract】 AIM: To isolate and culture human placentaderived adherent cells (hPDAC) in vitro and study their biological characteristics involving morphology， phenotype and differentiation. METHODS: Mononuclear cells were harvested after placenta tissue was digested by collagenase IV， seeded and cultured in lowglucose DMEM containing 100 mL/L FBS. Their surface markers were detected by flow cytometry; the growth curve was made; cells of 3 passages were induced to differentiate into osteoblasts with vitamin C， dexamethasone and sodium βglycerophosphate， and the induced cells were observed in the change of matrix mineralization with alizarin red staining; cells of 3 passages were induced to differentiate into lipocytes with dexamethasone and insulin， and the induced cells were observed with oil red O staining. RESULTS: By day 7-14， a few of adherent cells were observed and expanded the same as fibroblasts， and adherent cells were positive for CD29， CD44 and CD105， but negative for CD34， CD45， CD19. After 10day induction， alizarin red staining showed the calcium mineralization and after 7 d， oil red O staining revealed the appearance of fat drops. CONCLUSION: The hPDAC was confirmed to have the osteogenic and adipogenic potentials， indicating that they could be regarded as an alternative source of stem cells.
【Keywords】 placenta; adherent cells; stem cells
【摘要】 目的： 通過體外分離和培養(yǎng)胎盤貼壁細胞，以研究其形態(tài)、表型和分化特點. 方法： 采用IV型膠原酶消化人胎盤組織，獲得單個核細胞，接種于100 mL/L FBS 低糖DMEM培養(yǎng)基中，貼壁后常規(guī)換液、傳代，流式細胞儀檢測其表面標志，繪制生長曲線. 采用β甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松聯(lián)合誘導，使胎盤貼壁細胞分化為成骨細胞，誘導后10 d行茜素紅染色；采用地塞米松、胰島素誘導，使胎盤貼壁細胞分化為脂肪細胞，油紅O染色鑒定. 結(jié)果： 培養(yǎng)7~14 d后有少量貼壁細胞生長，逐漸呈成纖維細胞狀，表達CD29，CD44和CD105，不表達CD34，CD45，CD19；在成骨誘導10 d后細胞茜素紅染色可見鈣鹽沉積，成脂肪誘導7 d后油紅O染色見脂肪滴形成. 結(jié)論： 通過不同方式誘導培養(yǎng)，胎盤貼壁細胞可分化為成骨細胞及脂肪細胞，提示胎盤貼壁細胞可能是新的干細胞來源.
【關(guān)鍵詞】 胎盤；貼壁細胞；干細胞
0引言
間充質(zhì)干細胞（marrow stromal cell， MSC）主要來源于骨髓，可以分化為多種組織細胞：成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)細胞等，但隨著年齡增長或合并感染、腫瘤等疾病時骨髓干細胞的分化能力明顯下降，因此尋找新的干細胞成為當務之急. 近幾年來有學者發(fā)現(xiàn)胎盤組織中存在MSC. 為進一步證實這一發(fā)現(xiàn)，我們從胎盤中提取貼壁細胞，觀察其生物學特性，以探討其是否具有干細胞特性.
1材料和方法
1.1材料足月剖宮產(chǎn)的胎盤（產(chǎn)婦同意），低糖DMEM（Gibco公司），新生牛血清（FBS，Gibco公司），IV型膠原酶（Sigma公司），胰蛋白酶（Sigma公司），鼠抗人單克隆抗體CD19，CD44，CD45，CD105，CD34，CD29（晶美公司），茜素紅（Sigma），油紅O（Sigma），倒置顯微鏡（Olympas），CO2培養(yǎng)箱（Jouan）.
1.2方法
1.2.1胎盤貼壁細胞的分離和培養(yǎng)取足月剖宮產(chǎn)胎盤，剪取胎兒側(cè)胎盤組織，PBS反復沖洗，剪成碎塊，以1 g/L IV型膠原酶37℃消化30 min，取上清液，以800 r/min離心5 min，沉淀物重復消化，收集每次離心后的細胞沉淀，PBS沖洗2遍，以1×107/L的密度接種于100 mL/L FBS DMEM培養(yǎng)基中，貼壁后3~5 d換液1次，取傳3代以上細胞備用.
1.2.2胎盤貼壁細胞的表型測定取第3代細胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，100 mL/L FBS終止消化，PBS沖洗2遍，調(diào)整細胞數(shù)為1×104/μL，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD19， CD44， CD45， CD105， CD34，流式細胞儀檢測細胞表型.
1.2.3生長曲線的繪制取第3代細胞，以2×107/L的密度接種于12孔板中，每日取3復孔，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)7 d，計算平均值，繪制生長曲線.
1.2.4細胞周期測定取第3代細胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，10 mol/L FBS終止消化，PBS沖洗2遍，調(diào)整細胞數(shù)為1×106/L，流式細胞儀檢測細胞周期.
1.2.5細胞誘導分化及染色取第3代胎盤細胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min， 10 mol/L FBS終止消化，800 r/min離心5 min，PBS沖洗3遍，分為4組分別以1×105/L細胞數(shù)接種于6孔板中，1組加入成骨誘導劑（20 mmol/L β甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C，10 mmol/L地塞米松，100 mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基），2組加入脂肪誘導劑（10 mmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、100 mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基），3，4組為對照組，采用100 mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃，50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)，每3~5日換液1次. 取培養(yǎng)10 d后的1，3組細胞，倒掉培養(yǎng)液，多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8 h，顯微鏡下觀察陽性結(jié)果. 取培養(yǎng)7 d后的2，4組細胞，多聚甲醛固定后油紅O染色.
2結(jié)果
2.1胎盤細胞的原代培養(yǎng)消化胎盤組織獲得少量的單個核細胞，約7~14 d后貼壁，從不規(guī)則形，逐漸變?yōu)樗笮?，呈漩渦狀生長，約4 wk后長滿瓶底，胞體呈細長，形態(tài)類似成纖維細胞（圖2），1 wk左右傳代1次，可穩(wěn)定傳至10代. 流式細胞儀檢測顯示低表達CD29，高表達CD44和CD105，不表達CD34，CD45和CD19. 細胞的對數(shù)生長期約在第2~4日，其倍增時間為39 h（圖1）. 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)G0/G1，S，G2/M期的比例分別為20.15%， 72.54%和6.89%.
圖1胎盤貼壁細胞生長曲線（略）
2.2胎盤細胞的誘導分化成骨誘導組細胞在誘導10 d時可見細胞呈漩渦狀重疊生長，并聚集成團，茜素紅染色可見多個散在分布大小、形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結(jié)節(jié). 對照組少見鈣化結(jié)節(jié)（圖3）. 成脂肪誘導組細胞在誘導7 d時油紅O染色可見細胞中出現(xiàn)多個染色深紅的脂肪滴，而對照組中則偶見脂肪滴（圖4）.
A： 培養(yǎng)10 d；B： 培養(yǎng)28 d.
圖2胎盤原代細胞×100（略）
A：誘導組; B：對照組.
圖3成骨細胞茜素紅染色 ×100（略）
A：誘導組；B：對照組.
圖4成脂細胞油紅O染色 ×100（略）
3討論
早在2000年即有學者從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出貼壁細胞［1］，但胎盤間充質(zhì)干細胞（MSC）的研究尚處于起步階段. 我們從形態(tài)學、免疫學及分化能力等方面加以研究進一步證實胎盤貼壁細胞的生物學特性. 一般認為大多數(shù)MSC培養(yǎng)時貼壁，呈成纖維細胞狀，因而采用貼壁法獲得MSC的研究較多［2］. 胎盤是實體組織，富含血管和間充質(zhì)成分，我們采用酶消化法，獲取細胞沉淀進行培養(yǎng)，與骨髓貼壁細胞相比較，其貼壁時間較長（1~2 wk），骨髓為72 h［3］，并且胎盤貼壁細胞需28 d左右才能鋪滿瓶底. 骨髓貼壁細胞大多最初為梭形，7 d左右形成小集落，其后迅速生長，變?yōu)榫坏拈L梭形［3］，與胎盤貼壁細胞相似. 另外我們的實驗檢測到的胎盤貼壁細胞的倍增時間為39 h，文獻中為37 h［4］；我們檢測細胞周期顯示細胞大部分處于分裂期，而以往的報道發(fā)現(xiàn)細胞大部分處于靜息期［4］，因而胎盤貼壁細胞的特性尚需進一步研究.
目前對于胎盤貼壁細胞的免疫學特點尚無統(tǒng)一的認識，我們的研究發(fā)現(xiàn)胎盤貼壁細胞的表型與骨髓MSC相似［5-6］，表達CD29， CD44和CD105，不表達CD34， CD45， CD19， CD44， CD29均為黏附分子，是纖連蛋白和透明質(zhì)酸鹽的受體，在基質(zhì)細胞中表達較多，這樣的結(jié)果使我們推測培養(yǎng)的胎盤貼壁細胞中可能包含大量的能表達基質(zhì)細胞標志的細胞，即MSC，但僅憑細胞形態(tài)和少量的表面標志尚不能完全說明貼壁細胞即為MSC，MSC的最重要特性應該是多向分化潛能.
如果胎盤貼壁細胞中含有MSC，理論上講MSC來源于中胚層，具有向中胚層組織及神經(jīng)外胚層組織分化的能力［7-8］. 我們的實驗證明β甘油磷酸鈉和低濃度的地塞米松聯(lián)合誘導后細胞中鈣鹽沉積，茜素紅染色顯示產(chǎn)生大量鈣化結(jié)節(jié)，說明其有成骨能力，只有干細胞才具有這種能力. 在誘導體系中維生素C可以促進體外培養(yǎng)細胞合成膠原，形成鈣化，能調(diào)節(jié)ATP及ALP活性，并影響其合成，β甘油磷酸鈉可以提供磷離子作為ALP的底物，地塞米松可以增強ALP活性. 而ALP可以破壞鈣化抑制劑，啟動鈣化［8］形成鈣鹽，茜素紅特異性結(jié)合鈣劑，陽性表現(xiàn)為棕紅色，鈣的含量愈高染色愈深，是鑒定成骨細胞特性的特異性指標.
我們的實驗由于條件限制，只是初步觀察胎盤貼壁細胞的特點，證明其具有干細胞特性，但尚有許多問題如培養(yǎng)的條件、促進生長的因子、傳代后是否逐漸衰老、誘導后移植的效果等等，需更深入的研究. 我們的研究提示胎盤貼壁細胞的分離培養(yǎng)具有潛在的臨床應用價值.
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第4篇：細胞生物學特性范文
摘要：目的 研究流式細胞術(shù)DNA含量及S期細胞比值(SPF)測定及其與肺癌臨床病理指標的關(guān)系。方法 應用流式細胞儀(FCM)對56例肺癌新鮮組織及36例非癌性病變的肺新鮮組織的DNA含量(DI)和SPF進行測定，并結(jié)合臨床病理資料分析其意義。結(jié)果 ①肺癌病變組織DNA含量、SPF均顯著高于非癌性病變組織(P
關(guān)鍵詞：肺癌；流式細胞儀；DNA含量；生物學特征
Relation of FCM DNA content and Sphase fraction to the biological characteristics of lung cancer
ABSTRACT: Objective To investigate the relation of DNA content and SPF to the clinicopathological characteristic in lung cancer. Methods Fresh specimens taken from 56 patients with lung cancer and 36 patients with nonmalignant pulmonary lesions were measured for DNA index(DI)， Sphase fraction (SPF) by using FACSCalibur 4200 flow cytometry. Results ① DNA index(DI) of lung cancer was 1.18±0.33， 0.99±0.07 in lung cancer and nonmalignant groups， respectively. The percentage of heteroploid was 78.6% in lung cancer， 5.6% in nonmalignant. DI and the positive rate of heteroploid were significantly higher in lung cancer groups than that in nonmalignant group(P0.05); ③ It was demonstrated that SPF was significant higher in lung cancer groups than that in nonmalignant group. The SPF of heteroploid tumors was higher than that of diploid tumors(P
KEY WORD: lung cancer; flow cytometry; DNA content; biological characteristic
惡性腫瘤的染色體變化是腫瘤的基本生物學特征之一。研究表明，人類大多數(shù)腫瘤細胞的染色體都有異常，表現(xiàn)為染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常。異倍體的出現(xiàn)是惡性腫瘤的特征之一[12] 。在細胞惡變過程中因染色體的畸變使細胞DNA含量發(fā)生改變，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后中均具有重要意義。本研究對56例肺癌及36例肺非癌性病變的新鮮組織進行流式細胞儀(FCM)DNA含量、S期細胞比值(Sphase fraction， SPF)測定，并分析DNA含量、SPF與肺癌臨床病理指標的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 觀察對象 選擇2002年3月至2002年12月在我院手術(shù)切除和經(jīng)纖支鏡活檢的肺癌標本共56例(手術(shù)切除的肺癌標本15例，經(jīng)纖支鏡活檢的肺癌標本41例)，其中男性44例，女性12例。年齡30-78歲，平均55歲。病理類型：鱗癌33例、腺癌11例、小細胞癌12例。術(shù)前均未行任何放、化療。TNM分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期20例、Ⅲ期23例、Ⅳ期11例。36例非癌性病變(手術(shù)切除標本15例，經(jīng)纖支鏡活檢標本21例)，其中男性17例，女性19例。年齡13-69歲，平均46歲。均經(jīng)病理檢查證實為非癌性病變，其中符合結(jié)核肉芽腫10例，血管瘤2例，炎性假瘤6例，支氣管黏膜慢性炎15例，鱗狀化生2例，黏膜急性炎1例。
1.2 主要儀器與試劑 OLMPUS BP40纖支鏡(日本)，OLMPUS CLEIU冷光源(日本)，F(xiàn)ACScalibur流式細胞儀(美國BD公司)，分析用 Macintosh計算機(美國蘋果公司)，Allegra 21R臺式低溫離心機(美國Coulter公司)。PBS緩沖液(美國Beckmancoulter公司)，組織培養(yǎng)液(美國BD公司)，溶血素(美國BD公司)，DNA試劑盒(美國BD公司)。
1.3 實驗方法
1.3.1 樣本制備 由手術(shù)切除和經(jīng)纖支鏡活檢的新鮮標本約0.5g，立即置培養(yǎng)液中4℃冰箱保存，于1h內(nèi)制成單細胞懸液(flow cytometry， FCM)備DNA檢測。所有患者同時同部位另取標本置10%(體積分數(shù))甲醛溶液中固定送病理檢查。
1.3.2 流式細胞術(shù)DNA含量及細胞周期分析 將手術(shù)或纖支鏡所取標本離體后立即置2mL培養(yǎng)液中，將組織用銳利的剪刀切碎至1mm大小，放在180目銅網(wǎng)上輕搓，邊搓邊以PBS液緩慢沖下，收集細胞懸液，以1000r/min離心沉淀5min，去上清液，加入溶血素2mL作用10min，PBS漂洗2次，離心沉淀(1000r/min，5min)，棄上清液，加入95%(體積分數(shù))冰乙醇，配成終濃度為70%的細胞懸液固定，置4℃冰箱待檢。測定前用PBS洗滌3次，棄上清液，加入A溶液250μL(內(nèi)含30mg/L胰蛋白酶)混勻后靜置10min，再加入B溶液(內(nèi)含100mg/L Rnase A)200μL，混勻后靜置10min，最后加入C溶液200μL，混勻后避光靜置10min，調(diào)整細胞濃度為1×106，上機檢測。使用流式細胞儀進行樣本檢測，測定前使用標準微球校準儀器的CV值在3以內(nèi)。
1.3.3 分析指標 以DNA指數(shù)(DI值)表示DNA含量，依據(jù)DI值判定DNA倍體，0.9≤DI≤1.1 為DNA二倍體；DI1.1為異倍體。DNA異倍體的判定：在DNA直方圖上出現(xiàn)明顯的兩個峰且異倍體細胞群至少應含5%-10%的細胞或核同時DI1.1。同時測定SPF。
DI=腫瘤細胞G0/G1峰道數(shù)/正常二倍體細胞G0/G1峰道數(shù)
SPF(%)=[S÷(G0/G1+S+G2M)]×100%
1.3.4 病理切片的制備 以常規(guī)石蠟切片程序制片，HE染色，由病理診斷醫(yī)師按照WHO肺癌國際組織學分類標準，對肺癌的細胞類型、分化進行分類。
1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗，兩樣本率間比較采用χ2檢驗。相關(guān)分析采用spearmans法。應用單因素方差分析(OneWay ANOVA)比較肺癌各細胞類型、臨床分期、病理分級間DI、SPF的差異，兩兩比較采用LSD法。
2 結(jié)果
2.1 不同類型組織DNA含量和增殖性 56例肺癌病變組織DI為0.61-2.23，平均為1.18±0.32；SPF為3.17-30.44，平均為10.44±6.23；DNA異倍體陽性率為78.6%(44/56)；CV值2.98-8.01，平均6.13±1.42。36例非癌性病變組DI 0.90-1.18，平均為0.99±0.07；SPF 0.3-6.24，平均為2.33±1.31；DNA異倍體陽性率為5.6%(2/36)，CV 3.48-7.80，平均6.37±1.73。 肺癌組與非癌性病變組相比，DI 、SPF、DNA異倍體陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P
2.2 肺癌組織DNA含量、增殖性與肺癌組織學類型、組織分化程度以及臨床TNM分期的關(guān)系 56例肺癌中小細胞肺癌者12例，DI、SPF平均為1.28±0.39、13.96±9.71；非小細胞肺癌44例，DI、SPF平均為1.16±0.30、9.48±4.60，兩組相比差異無顯著性(P>0.05)。44例非小細胞肺癌中有8例由于取材原因組織分化程度難以判定，僅對其中36例進行分析：高-中分化共11例(高分化8例、中分化3例)，低分化25例。隨組織分化程度降低DI、SPF有增高的趨勢，但兩組相比差異無顯著性(P>0.05)。56例肺癌DI隨腫瘤TNM分期增加有增加的趨勢，但各組間差異無顯著性；肺癌各臨床分期SPF分別為：Ⅰ- Ⅱ期7.72±3.16、Ⅲ 期11.86±7.65、Ⅳ期16.53±7.37。隨臨床分期增加SPF相應增加，差異有顯著性(P
3 討論
DNA是染色體的主要成分，人體除少數(shù)增生代謝活躍的組織外，正常體細胞均為恒定的二倍體DNA含量。在細胞癌變的過程中，由于染色體的畸變，使細胞DNA含量也隨之改變。在本實驗中，56例肺癌組織的DNA含量遠較非癌性病變組為高，從而證實了惡性細胞的DNA含量高于正常細胞，DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的重要標志[1] 。在本實驗中，尚有21.4%的腫瘤DNA倍體分析為正常二倍體DNA含量，原因可能與以下因素有關(guān)：①二倍體腫瘤，大量研究表明少數(shù)的腫瘤細胞可以表現(xiàn)為正常二倍體的DNA含量；②一些腫瘤可能同時存在染色體的丟失和復制，DNA的凈含量未發(fā)生變化，異倍體無法檢出來[2]；③腫瘤細胞的異質(zhì)性，造成DNA含量分布不均[34] ；④相對于二倍體來講，異倍體細胞極少，在進行流式細胞儀檢測時DNA異倍體峰被二倍體峰掩蓋[5]。
本組資料顯示DI與肺癌部位、吸煙、病理類型、臨床分期等指標間未見相關(guān)性，與Tinnemans[6]、Pina[4]結(jié)果相似。提示染色體的不穩(wěn)定性、細胞DNA含量增高持續(xù)存在于肺癌發(fā)生、發(fā)展的各個時期。另有學者認為DI 與肺癌臨床分期、病理分化程度密切相關(guān)[7]，考慮其差別可能與病例的選擇、樣本大小以及取材等因素有關(guān)。此外，本組資料顯示，反映細胞增殖活性的指標SPF在癌性組織中明顯高于非癌性組織，且SPF與臨床分期、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNMN)、遠處轉(zhuǎn)移(TNMM)相關(guān)。隨肺癌臨床TNM分期的增加，SPF均相應增加并有統(tǒng)計學差異。提示良惡性組織間存在明顯的增殖能力的差別，惡性組織的增殖能力明顯高于非癌性病變，肺癌組織的增殖能力與腫瘤分期、浸潤、轉(zhuǎn)移等預后因素相關(guān)，高增殖狀態(tài)的肺癌具有更大的轉(zhuǎn)移潛能。本組資料顯示異倍體腫瘤SPF較二倍體腫瘤高。提示惡性腫瘤間增殖能力是有差別的，相對于二倍體腫瘤，異倍體腫瘤增殖活性更高、分裂期的細胞數(shù)目更多、生長更快、進展更迅速，這可能是異倍體腫瘤預后差的原因之一[89]。
總之，應用FCM對肺癌組織DNA含量及增殖活性的研究，有助于評價肺癌的進展和轉(zhuǎn)移，可作為評價肺癌生物學行為的指標之一。
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第5篇：細胞生物學特性范文
【摘要】
目的: 研究抗人CD40單克隆抗體（mAb）5H6的125I標記及與卵巢癌細胞株HO8910體外結(jié)合的生物學特性。方法: 氯氨T法125I標記mAb 5H6(125I5H6)， 紙層析法測定125I5H6的標記率和放射化學純度， 三氯醋酸沉淀法分析125I5H6體外穩(wěn)定性， 細胞結(jié)合飽和實驗進行Scatchard分析， lindmo法及其改良方法計算125I5H6的免疫活性分數(shù)， 細胞結(jié)合實驗分析125I5H6同HO8910細胞的內(nèi)化和滯留。結(jié)果: (1)mAb 5H6的125I標記率為（85.4±5.2）％， 放射化學純度為(99.2±0.5)%。(2)125I5H6存放于4℃磷酸緩沖液中7 d后其放射化學純度為(80.3±4.7)%， 在37℃血漿中存放24 h后其放射化學純度為(95.3±0.8)%。(3) 125I5H6與HO8910細胞親和力Kd=(0.711±0.06) nmol/L， 最大結(jié)合位點數(shù)(Bmax)=(2.17±0.08）×105個/細胞。(4)125I5H6免疫活性分數(shù)達(38.6±5.4)%。(5)4℃ 2 h 125I5H6同HO8910細胞滯留率為(89.8±6.0)%， 37℃ 2 h 125I5H6同HO8910細胞內(nèi)化率達(54.9±2.6)%。結(jié)論: 氯氨T法進行125I5H6標記具有良好的標記率和放射化學純度， 以及良好的體外穩(wěn)定性和較高的免疫活性分數(shù)， 且125I5H6與HO8910細胞具有很高的親和力， 可用于動物體內(nèi)實驗。
【關(guān)鍵詞】 125I標記 氯氨 T法 CD40 卵巢腫瘤 單克隆抗體
［Abstract］ AIM: To prepare iodine125 labeled antihuman CD40 monoclonal antibody 5H6 (125I5H6) and investigate the binding properties of 125I5H6 to HO8910 cells in vitro. METHODS: The mAb 5H6 was labeled with Na125I using chloramineT method. The labeling efficiency and radiochemical purity of 125I5H6 were measured by paper chromatography. The stability of 125I5H6 in vitro was monitored by trichloroacetic acid (TCA) precipitation. The dissociation constant (Kd) of 125I5H6 from HO8910 cells and the numbers of maximum binding sites (Bmax) were obtained by Scatchard analysis. Immunoreactivity of 125I5H6 to HO8910 cells was determined by “Lindmo” assay and its improved method. Internalization and retention of 125I 5H6 by HO8910 cells were studied by cell binding experiments. RESULTS: (1)The labeling efficiency of 125I5H6 was （85.4±5.2）% and its radiochemical purity was (99.2±0.5)% . (2)Radiochemical purity of 125I5H6 was (80.3±4.7)% after 7 days in 4℃ PB (phosphate buffer) and (95.3±0.8)% after 24 hours in 37℃ plasma. (3)At 4℃， Kd for 125I5H6 to HO8910 cells was (0.711±0.06) nmol/L and Bmax was （2.17±0.08）×105 sites/cell. (4)Immunoreactivity of 125I5H6 was (38.6±5.4)%. (5)Retention rate of 125I5H6 with HO8910 cells was (89.8±6.0)% after 2 hours at 4℃ and internalization rate of 125I5H6 by HO8910 cells was (54.9±2.6)％ after 2 hours at 37℃. CONCLUSION: 125I5H6 possesses good labeling efficiency and perfect radiochemical purity. 125I5H6 has suitable stability in vitro and its immunoreactivity was not low. The high affinity of 125I5H6 with HO8910 cells will benefit further animal study in vivo.
［Keywords］iodine125 labeling; chloramineT method; CD40; ovary tumor; monoclonal antibody
卵巢癌的死亡率高居婦科惡性腫瘤之首， 雖然經(jīng)過傳統(tǒng)的手術(shù)、 化療和放射治療， 病情可獲緩解， 但復發(fā)率高， 上皮性卵巢癌的總體5年存活率僅30％， 且卵巢癌患者晚期生存質(zhì)量很差［1］。近年卵巢癌的免疫治療成為備受關(guān)注的一種新的輔助治療方法， 采用腫瘤特異性或者相關(guān)抗體對卵巢癌進行放射免疫診斷和治療逐步成為一種新的方法［2］。
CD40分子屬于TNF受體超家族成員， 主要表達在B細胞、 樹突狀細胞（DC）、 上皮細胞以及一些腫瘤細胞上。業(yè)已表明， 卵巢癌、 膀胱癌、 乳腺癌等腫瘤細胞株和新鮮腫瘤組織都表達CD40分子， 而通過單克隆抗體（mAb）激發(fā)CD40分子不僅可以直接作用于腫瘤細胞， 其介導的信號還可在多個環(huán)節(jié)影響腫瘤發(fā)生、 發(fā)展［3］。本所研制的mAb 5H6是鼠抗人CD40新位點mAb， 我們采用氯氨T法進行125I標記mAb 5H6(125I5H6)， 獲得了高放射化學純度、 良好體外穩(wěn)定性和較高免疫活性分數(shù)的125I5H6， 為不同放射性碘標記mAb 5H6以及建立放射免疫顯像和靶向治療方法奠定了初步實驗基礎。
1 材料和方法
1.1 材料 卵巢癌細胞株HO8910、 人血管內(nèi)皮細胞株Eahy926 (中國科學院上海細胞研究所) 由本所保存; 鼠源性抗人CD40 mAb 5H6（IgG1）、 5C11（IgG1）均為本所研制。RPMI1640 培養(yǎng)基（GIBCO公司， 美國）， 無還原劑Na125I （成都中核高通同位素股份有限公司）， 氯氨T（Sigma公司， 美國）， 偏重亞硫酸鈉（Fluka公司， 德國）， Sephadex G25(GE公司， 美國)， 其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。CO2培養(yǎng)箱， 離心機(Jouan 公司， 法國)， 倒置顯微鏡(Olympus 公司， 日本)， 流式細胞儀(BeckmanCoulter公司， 美國)， CRC15R型放射性核素活度計(CAPINTEC公司， 美國)， SN695B型放免γ測量儀（上海核所日環(huán)光電儀器有限公司）。
1．2 方法
1.2.1 mAb 5H6與HO8910細胞特異性結(jié)合的檢測 將細胞HO8910及對照細胞Eahy926調(diào)至5×109/L， 分別取100 μL同2 μg 5H6或5C11， 4℃孵育45 min， PBS洗2次， 加入PE羊抗鼠二抗， 4℃孵育45 min， PBS洗2次， 懸浮于0.5 mL PBS中， 進行流式細胞術(shù)分析。
1.2.2 mAb 5H6的125I標記及純化 采用氯氨T法［4］對mAb 5H6進行 125I標記: 分取70 μL (0.05 mol/L， pH=7.4) PB液（磷酸緩沖液）， 20 μg 5H6， 1 mCi Na125I， 50 μL（1 g/L）氯胺T溶液， 混合振蕩60 s， 用100 μL （1 g/L）偏重亞硫酸鈉溶液終止反應1 min; 將標記液用預先平衡Sephadex G25柱（Ф1×5 cm）純化， 采用含1 g/L BSA（牛血清白蛋白）的PBS洗脫， 收集洗脫液（0.5 mL/瓶）。
1.2.3 標記率、 放射化學純度測定及穩(wěn)定性分析 采用紙層析法測定抗體標記率和放射化學純度， 以新華1號層析紙為固定相， 生理鹽水為展開劑， 用γ放射免疫計數(shù)器測量各段放射性計數(shù)， 計算標記率（純化前標記物峰的計數(shù)占各峰總計數(shù)的百分比）和放射化學純度（純化后標記物峰的計數(shù)占各峰總計數(shù)的百分比）。125I5H6在體外的穩(wěn)定性: 將125I5H6分別存放于4℃ PB液、 37℃生理鹽水、 37℃血漿中， 于不同時間點采用100 mL/L TCA（三氯醋酸）沉淀法測定其放射化學純度。
1.2.4 細胞結(jié)合動力學實驗 分為總結(jié)合（total binding， TB）和非特異性結(jié)合(nonspecific binding， NSB)兩組。TB組各實驗管加5×105個HO8910細胞和20 ng125I5H6， NSB組各管則比TB組多加20 μg未標記抗體5H6（封閉特異性抗原結(jié)合位點）， 在室溫孵育10 min、 30 min、 1 h、 2 h、 4 h、 6 h， 其中每組每個時間點均設兩個平行管， 反應結(jié)束時先測各管總投入（total， T）的放射性計數(shù)， 離心棄上清， 用含1 g/L BSA的PBS洗滌2次后， 測其沉淀部分即結(jié)合的放射性計數(shù)， 由TB管沉淀部分的放射性計數(shù)減去相應的NSB管沉淀部分的放射性計數(shù)可得特異性結(jié)合（specific binding， SB）的放射性計數(shù)， 并由T減去相應的SB可得未結(jié)合即游離部分（free， F）的放射性計數(shù)。
1.2.5 細胞結(jié)合的飽和實驗及Scatchard分析 TB組各實驗管加5×105個HO8910細胞和不同終濃度125I5H6， NSB組各管則比TB組各管多加1 000倍的未標記5H6， 在4℃孵育1 h， 其中每組每個濃度點均設兩個平行管。以125I5H6濃度為橫坐標， SB及NSB所對應的125I5H6量為縱坐標， 繪制細胞結(jié)合的飽和曲線。Scatchard分析: 以SB對應的標記抗體的終濃度為橫坐標， SB與F的比值（記作B/F）為縱坐標進行直線擬合， 根據(jù)公式B/F=C·Ka-Ka·B(Ka為親和常數(shù))得出抗體與細胞結(jié)合的親和力（用解離常數(shù)Kd＝1/Ka表示）及最大結(jié)合位點數(shù)（number of maximal binding sites， Bmax）， 其中Ka為擬合直線的斜率， Bmax為擬合直線在x軸上的截距。
1.2.6 免疫活性分數(shù)計算 采用lindmo法［5］和改良的lindmo法對125I5H6免疫活性分數(shù)分別進行計算。Lindmo法: 在倍比稀釋的6個不同濃度的HO8910細胞懸液中， 加入20 ng 125I5H6， 室溫反應45 min。另一組非特異結(jié)合管， 在加入125I5H6前， 先加入20 μg非標記5H6以封閉特異性抗原結(jié)合位點。以細胞密度的倒數(shù)為橫坐標， 加入的125I5H6總計數(shù)T(代表125I5H6的總濃度［T］)與結(jié)合部分計數(shù)B(代表結(jié)合抗體濃度［B］)的比值［T］/ ［B］為縱坐標作圖， 并擬合直線方程， 縱坐標上的截距的倒數(shù)即125I5H6的免疫活性分數(shù)。改良的Lindmo法實驗步驟同細胞結(jié)合的飽和實驗， 最后繪圖時以總計數(shù)［T］為橫坐標、 ［T］/［B］為縱坐標， 作圖并擬合直線方程， 縱坐標上截距的倒數(shù)即125I5H6的免疫活性分數(shù)。
1.2.7 125I5H6同HO8910細胞內(nèi)化及滯留實驗 將HO8910細胞貼壁培養(yǎng)于10 cm2的培養(yǎng)皿， 加入1 μCi 125I5H6， 在4℃孵育1 h后用冰冷的培養(yǎng)液洗2次， 再加入2 mL冰冷的培養(yǎng)基， 將培養(yǎng)皿分別置于37℃和4℃下， 于不同時間點收集培養(yǎng)液， 每個時間點設3個復皿。首先用不同時間點分離的培養(yǎng)液計數(shù)來測定從胞膜表面脫落的125I5H6， 然后用冰冷的pH值為2.25的培養(yǎng)液洗2次， 所得洗脫液計數(shù)來測定胞膜表面的125I5H6， 最后用胰酶消化下來細胞懸液的計數(shù)來測定胞內(nèi)的125I5H6。1.2.8 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)用x±s表示， 采用SPSS13.0軟件包處理， t檢驗行顯著性分析。
2 結(jié)果
2.1 mAb 5H6特異性識別HO8910細胞表達的CD40分子 mAb 5H6能特異性結(jié)合人卵巢癌細胞株HO8910， 而同型對照抗體和陰性對照人血管內(nèi)皮細胞株Eahy926未檢測到陽性表達（圖1）。
圖1 流式細胞術(shù)檢測抗人CD40 mAb與HO8910和Eahy926細胞的反應性（略）
Fig 1 Reactivity of antihuman CD40 mAbs with HO8910 and Eahy926 cells examined by FCM
2.2 125I5H6標記率、 放射化學純度及穩(wěn)定性 經(jīng)過3次對mAb 5H6標記重復實驗得出， 125I5H6標記率為（85.4±5.2）％， 純化后游離碘
2.3 125I5H6與HO8910細胞體外的結(jié)合動力學實驗 125I5H6與HO8910細胞的總結(jié)合（TB）隨孵育時間的延長明顯高于非特異性結(jié)合(NSB)， 因此兩者相減而得的特異性結(jié)合(SB)亦隨時間遞增， 尤其在孵育1 h內(nèi)迅速增加， 2 h后趨于平坦， 表現(xiàn)出明顯的時間依賴性。另外， NSB組也隨時間的延長呈線性增加， 由此表明未標記的5H6能競爭性結(jié)合HO8910細胞表面的抗原， 從而抑制125I5H6與HO8910細胞的結(jié)合（圖2）。
圖2 125I5H6與HO8910細胞結(jié)合動力學曲線（略）
Fig 2 Conjugation dynamics of 125I5H6 to HO8910 cells
2.4 125I5H6與HO8910細胞結(jié)合的飽和實驗及Scatchard分析 在4℃下， 125I5H6與HO8910細胞作用的TB、 NSB和SB都隨125I5H6量的增加而增加， 其中SB符合飽和曲線規(guī)律: 當125I5H6低于0.5 nmol/L時， SB迅速增加， 高于1 nmol/L時緩慢增加并趨于平坦， 而NSB則呈線性增加， 無飽和趨勢（圖3）。Scatchard分析125I5H6與HO8910細胞的親和力Kd值為(0.711±0.06) nmol/L， 最大結(jié)合位點數(shù)（Bmax）為（2.17±0.08）×105個/細胞， 表明125I5H6同HO8910細胞具有很高的親和力（圖4）。
圖3 125I5H6與HO8910細胞結(jié)合飽和曲線（略）
Fig 3 Saturation binding of 125I5H6 to
HO8910 cells
圖4 Scatchard分析125I5H6與HO8910細胞親和力及最大結(jié)合位點數(shù)（略）
Fig 4 Analysis the affinity and Bmax of 125I5H6 to HO8910 cells by Scatchard plot
2.5 125I5H6的免疫活性分數(shù) lindmo法計算125I5H6的免疫活性分數(shù)為(38.4±5.3)% (圖5)， 改良的lindmo法計算125I5H6的免疫活性分數(shù)為(35.8±3.9)% (圖6)， 兩種方法計算值無統(tǒng)計學意義。
圖5 lindmo 法計算125I5H6免疫活性分數(shù)（略）
Fig 5 Determination of immunoreactive fraction of 125I5H6 by lindmo assay
圖6 改良lindmo法計算125I5H6免疫活性分數(shù)（略）
Fig 6 Determination of immunoreactive fraction
of 125I5H6 by improved lindmo assay
2.6 125I5H6與HO8910細胞的內(nèi)化及滯留實驗 125I5H6與HO8910細胞結(jié)合后， 37℃時迅速內(nèi)化， 2 h內(nèi)化率達(54.9±2.6)％， 而在4℃幾乎不發(fā)生內(nèi)化(圖7)。在37℃時125I5H6在HO8910細胞上的滯留率2 h降到(29.2±1.0)％， 而在4℃ 2 h仍然有(89.8±6.0)%滯留(圖8) 。
圖7 125I5H6同HO8910細胞的內(nèi)化曲線（略）
Fig 7 Internalization of 125I5H6 by HO8910 cells
圖8 125I5H6同HO8910細胞滯留曲線（略）
Fig 8 Retention of 125I5H6 by HO8910 cells
3 討論
卵巢癌因缺乏有效的早期診斷方法且易復發(fā)而居婦科惡性腫瘤死亡率之首， 故卵巢癌早期診斷和術(shù)后追蹤的方法成為眾多學者關(guān)注的問題。CD40分子首先在上皮性腫瘤中發(fā)現(xiàn)， 繼而多種腫瘤組織和腫瘤細胞均能檢測到CD40分子的表達， 如血液系統(tǒng)腫瘤（CLL、 ALL、 AML、 Hodgkin’s淋巴瘤、 nonHodgkin’s淋巴瘤、 多發(fā)性骨髓瘤等）、 上皮性腫瘤（卵巢癌、 膀胱癌、 頭頸鱗狀細胞癌、 鼻咽癌、 直腸癌、 肝癌、 乳腺癌等）以及一些軟組織肉瘤。CD40 分子在腫瘤免疫應答中起著非常重要的作用， 其介導的信號可在多個環(huán)節(jié)影響腫瘤發(fā)生、 發(fā)展， 如調(diào)控細胞增殖/凋亡， 增強其他治療手段的敏感性， 還能通過調(diào)節(jié)適應性和固有免疫應答而起到抗腫瘤作用。目前雖然已研制出CD40人源化抗體， 并且有2株已進入臨床前期［6， 7］， 但CD40的廣泛表達將使抗體的臨床應用存在很大的副作用。本所研制的抗人CD40 mAb 5H6 完全不同于已報道的抗人CD40mAb［8］的識別譜， 它能識別多種腫瘤細胞株（HO8910，K562等）以及腫瘤新鮮組織表達的CD40分子， 而不識別血管內(nèi)皮細胞株Eahy926以及一些正常組織表達的CD40分子， 就可避開CD40的廣泛表達給抗體臨床應用帶來副作用， 顯示出潛在的應用價值， 這為利用特異性識別腫瘤細胞表達的CD40分子新位點的mAb 5H6作為靶向診斷和治療開拓新途徑。
我們采用經(jīng)典氯氨T法對mAb 5H6進行標記獲得很高的標記率和放射化學純度， 同時125I5H6也具有較高的免疫活性分數(shù)和良好的體外穩(wěn)定性， 采用125I5H6同卵巢癌細胞株HO8910結(jié)合分析了親和力和最大結(jié)合位點數(shù)。雖然125I5H6的免疫活性分數(shù)尚不理想， 主要原因是在標記反應中使用比較強的氧化劑氯氨T， 對抗體有氧化損傷， 因而造成活性的部分丟失， 但是我們初步得出125I5H6能同卵巢癌細胞株HO8910在體外具有很高得親和力， 可用于體內(nèi)實驗， 提示如使用123I、 125I、 131I等不同核特性的放射性核素標記mAb 5H6， 可望成為卵巢癌放射免疫診斷和治療的靶向生物導彈。同時如采用比較溫和的標記反應條件如Iodogen法， 或采用間接的金屬鰲合法同一些金屬性同位素進行標記［9］， 可進一步提高標記抗體活性和穩(wěn)定性以及在細胞上的滯留作用。
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第6篇：細胞生物學特性范文
關(guān)鍵詞：醫(yī)學細胞生物學；實驗教學；教學改革
醫(yī)學細胞生物學是醫(yī)學臨床專業(yè)的主干課程之一。學習此門課程對于我們從細胞水平理解生命現(xiàn)象，闡述機體發(fā)病原理及選擇最佳治療方案提供理論依據(jù)。同時，醫(yī)學細胞生物學又是一門實驗操作性極強的學科，實驗教學不僅是此門課程教學工作的重要組成部分，也直接關(guān)系到學生的動手能力、綜合素質(zhì)，是臨床學生正式走上醫(yī)療崗位前的一種必需的培訓。
但在實際的教學過程中，教師在實驗課中重點講授實驗的基本原理，實驗所要達到的目的，并在實驗前已將實驗所需的各種試劑配好，學生按實驗指導書無需思考地將相應的試劑按順序加入，然后得到一個合理的結(jié)果就可以。對于學習主動性差的學生來講，他僅僅是觀察到一個實驗現(xiàn)象。因此，我們感到實驗課程的內(nèi)容和設計并沒有達到我們最初預想的培養(yǎng)目的。那么，如何將實驗中所觀察到的現(xiàn)象很好地與理論知識結(jié)合起來，調(diào)動學生的主觀能動性，讓被動的學習變?yōu)橹鲃右赃_到預期的教學效果呢？為了解決這一問題，我們對現(xiàn)有的實驗課作了相應的改革，結(jié)合課堂理論教學，借鑒其他醫(yī)學院校的經(jīng)驗，讓學生自我設計，自我驗證，以加深對理論知識的理解，提高教學質(zhì)量。
在制定改革方案之前，我們與學生進行了多次深入的交流，從他們反饋回來的信息了解到，當代大學生具有較強的求知欲，渴望掌握當代相關(guān)學科領域中的新進展、新理論及相應的新技術(shù)，對于實驗課教學環(huán)節(jié)有著殷切的希望，希望能夠通過專業(yè)技能訓練，掌握幾門實用性強的技術(shù)，以提高自身在就業(yè)市場上的競爭力。與此同時，我們也深深感到他們的動手能力差，獨立處理問題、解決問題的能力較弱，吃苦鉆研精神不夠。此外，應試學習的現(xiàn)象在他們身上體現(xiàn)得較為普遍。綜合以上的分析，對醫(yī)學細胞生物學實驗課教學環(huán)節(jié)提出如下改革建議：
一、加強實驗基本技能的訓練，培養(yǎng)科學嚴謹?shù)膶W習作風
實驗包括顯微鏡的使用方法，生物繪圖的基本技巧，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，細胞亞微結(jié)構(gòu)的分離與觀察。主要目的是使學生掌握細胞學研究和觀察的基本實驗方法。此外，我們對實驗中的操作細節(jié)進行嚴格的要求，以培養(yǎng)學生良好的實驗習慣及嚴謹?shù)膶W習作風，這對于臨床專業(yè)的學生尤為重要。
二、開展綜合性、設計性實驗，調(diào)動學生的主觀能動性，提高動手能力，將被動學習變?yōu)橹鲃訉W習
結(jié)合理論課教學環(huán)節(jié)及相關(guān)臨床應用，提出問題，由學生獨立完成實驗方案設計，包括實驗相關(guān)原理，材料選擇，試劑配制，試驗現(xiàn)象的觀察記錄，以及最后的試驗結(jié)論，并提出對于實驗內(nèi)容在臨床上相關(guān)應用及意義。只有這樣，學生才能通過實驗加深對理論的理解，培養(yǎng)學生獨立處理問題、解決問題的能力。例如，根據(jù)實驗課教學大綱，細胞生物學第二次實驗中有一個“紅細胞膜通透性觀察”實驗。常規(guī)的教學方法就是由教師分別配制低滲、高滲、等滲8種試劑，利用人的血液在生理鹽水下平衡，學生僅需要加入不同的試劑觀察是否溶血，而后得出何種試劑能夠發(fā)生溶血現(xiàn)象。在實際教學過程中，學生只是機械地做實驗，而不能將實驗內(nèi)容與細胞膜的特性相聯(lián)系，實驗結(jié)束后學生僅僅掌握了溶血現(xiàn)象的觀察，紅細胞需要保存在等滲溶液中等一些表面現(xiàn)象。而無法加深對細胞膜通透性的理論知識的理解，實驗課流于形式。針對該實驗存在的一些問題，我們以本實驗為突破口，開展了設計性和探索性實驗。在具體教學環(huán)節(jié)上可做如下調(diào)整：
1.在理論課教學環(huán)節(jié)中，闡述細胞膜選擇通透性的原理，并提出一系列問題，包括：
（1）為什么臨床上輸液需輸入等滲溶液的？
（2）細胞膜針對不同分子其通透性有何變化？
（3）如何建立等滲溶液？
（4）水是如何通過細胞膜的？
（5）細胞的體積是如何維持的？
（6）腎臟是通過何種方式完成水和無機離子的重吸收？
2.由學生自己根據(jù)實驗目的設計實驗，設計內(nèi)容包括實驗目的，需要解決的問題，選擇何種試劑和材料，采用何種試驗方法。
3.學生也可采用實驗指導書安排的方案，該種方式兼顧到對實驗設計有困難的學生，可以完成基本的實驗。
4.專門安排三個學時的實驗課，組織學生針對自己的實驗設計開展討論，學生可以在討論課上闡述自己的設計理念，設計思路，完成實驗的可行性，在討論階段有些學生修改了自己的設計，有些學生借鑒別人的建議完善了自己的設計方案，同時也進一步鞏固了相關(guān)的理論知識。
5.學生完成實驗，實驗過程中做好實驗記錄，對實驗過程中出現(xiàn)的問題提出假設，并進一步給予驗證。
通過這種完整的實驗設計訓練，學生可以掌握科研設計的基本方法，同時結(jié)合理論與相關(guān)研究的最新進展充分發(fā)揮自己的主觀能動性，提出自己的設計方案并通過實驗進行驗證。這樣我們的實驗過程從教師教學生被動的學習變成了學生主動的探求知識的過程，學生的學習積極性充分被調(diào)動起來。
三、評分標準的改革
原來的醫(yī)學細胞生物學實驗成績主要是對實驗報告的評分，其中包括實驗目的、原理、操作步驟及觀察結(jié)果記錄，將這幾項分別評分，并相加得到最終的分數(shù)，這就導致學生在書寫報告時不用心，應付了事，抄襲現(xiàn)象嚴重。配合以上實驗內(nèi)容的改革，我們對評分標準也做了相應的改動。基礎性實驗評分重點放在討論題及注意事項上。拓寬學生對實驗基本技能在臨床應用上的思考，培養(yǎng)學生在實驗操作過程中發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力。對于綜合性、設計性實驗，評分的重點要放在對實驗設計的科學性、合理性以及實驗相關(guān)內(nèi)容擴展的評估上。通過這樣的評分改革進一步提高學生主動學習的積極性。
通過一輪的教學改革，我們從學生完成的實驗報告；醫(yī)學細胞生物學期末考試情況分析及隨機抽樣調(diào)查問卷三個方面對教學效果進行了評價。參加實驗教學改革的為206位2012級臨床醫(yī)學專業(yè)學生，經(jīng)過充分討論全部完成了實驗設計，其中90%的學生設計了與實驗指導書不同的方案，部分學生還結(jié)合臨床實踐做了一些有益的探索，如針對腎小管上NH+4轉(zhuǎn)運通道的研究，高滲與等滲混合液對紅細胞膜的影響，ATP對葡萄糖的易化擴散作用的影響。去垢劑SDS對紅細胞膜的影響，紅細胞膜上水通道蛋白的研究等。此外，基礎實驗技術(shù)的實驗完成效果也有明顯提高，學生不僅能主動查閱相關(guān)文獻擴展對基本技術(shù)應用的認識，而且對于實驗的每一個細節(jié)都認真分析，在報告中提出了不少的注意事項與建議。
為了進一步驗證實驗課改革的效果，在醫(yī)學細胞生物學期末考試試題中，安排了綜合性設計實驗相關(guān)的理論知識試題，其中90%的學生答對了該題，正確率遠大于其他的題目。這說明通過學生自己的設計，對于紅細胞膜的特性有一個深刻的認識，實驗課教學加深了學生對理論知識的理解，對相關(guān)的理論知識起到了有益的補充作用，實驗課教學改革達到了預期的效果。
此外，抽樣調(diào)查結(jié)果表明：學生對教學改革滿意度高，認為實驗課能調(diào)動他們的積極性，這樣的教學能讓他們愿意去發(fā)現(xiàn)問題、解決問題。同時，在主動思考的過程中對課堂上的理論知識的掌握具有一定的促進作用，并對實驗課的進一步改進提出了許多建議。
綜上所述，我們根據(jù)教學實踐過程中發(fā)現(xiàn)的一些問題做出的相應的實驗課改革，在實際的教改過程中仍發(fā)現(xiàn)有許多不完善之處，還有待日后的進一步完善與補充。但教學改革的效果也是喜人的。我們應堅持這樣的思路，將教學改革進行到底，對原有教學進行甄別，取其精華去其糟粕。擺脫教師機械講授的“填鴨式”教學模式，提高學生學習的興趣，改變學生的應試學習狀態(tài)，為社會培養(yǎng)出具有獨立思考能力，獨立解決問題能力的合格的臨床醫(yī)學人才。
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第7篇：細胞生物學特性范文
關(guān)鍵詞：獨立學院；生物技術(shù)；課程體系
中圖分類號：G642.0 文獻標識碼：C DOI：10.3969/j.issn.1672-8181.2016.11.150
現(xiàn)代生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展從1953年弗朗西斯•克里克和詹姆斯•沃森發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)開始，分子生物學、細胞生物學技經(jīng)過60年的發(fā)展把整個生物學帶入了嶄新的應用領域。生物技術(shù)的最大特點是涉及的技術(shù)種類多樣且復雜，是一門跨領域特性極強的綜合性學科，可廣泛應用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、軍事、工業(yè)、環(huán)境、能源等領域，其研究的深度和廣度可以小至分子、細胞乃至納米層次，也可大到組織、個體、群落甚至整個生態(tài)系統(tǒng)。如果沒有生物技術(shù)的一個公認的定義，就很難區(qū)分什么不是生物技術(shù)，生物技術(shù)學科相對獨立的學術(shù)體系，相對完整的理論框架將非常難于設置，人才培養(yǎng)課程體系的確立也無據(jù)可依。我國自1997年高校批準設立生物技術(shù)專業(yè)至今，普遍采用以基因工程、細胞工程、蛋白質(zhì)與酶工程、發(fā)酵工程為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)對生物技術(shù)定義進行界定，在人才培養(yǎng)上主要以理為主，以工為輔。生物技術(shù)的定義決定了生物技術(shù)專業(yè)教學的課程體系，課程體系依賴生物技術(shù)定義，并隨著定義的發(fā)展而調(diào)整。
1關(guān)于生物技術(shù)人才培養(yǎng)目標的確立
新的工程技術(shù)的出現(xiàn)，經(jīng)常是在學科的邊緣或交叉點上。由于一個專業(yè)要求多種學科的綜合，而一個學科是在不同領域的應用[1]，在我國高?，F(xiàn)行體制中，生物技術(shù)專業(yè)往往被等同于一個二級學科，以學科的定義成為高校教學、科研的功能單位，對教師教學、科研及為社會服務進行了界定。在這種模式下，生物技術(shù)面對大量的學科交叉應用，在教學上卻固步自封，本科專業(yè)方向設置狹隘，閉門造車，教育教學和產(chǎn)業(yè)應用脫節(jié)嚴重，在醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、軍事、工業(yè)、環(huán)境、能源等領域甘當配角，失去了生物技術(shù)專業(yè)在學科交叉領域的大好發(fā)展機遇。生物技術(shù)專業(yè)課程體系中的專業(yè)方向課程體現(xiàn)的應該是專業(yè)在多種學科的綜合后在某個領域的應用，是具體的人才培養(yǎng)應用方向。在生物技術(shù)強國美國[2]，斯坦福大學的生物學專業(yè)包括生物物理、海洋生物、分子與細胞生物學、神經(jīng)生物學、生態(tài)與進化生物學方向；哈佛大學直接將生命科學劃成了生物學和生物化學兩個專業(yè)，生物學從遺傳學和分子生物學跨越到生態(tài)學和古生物學，而生物化學專業(yè)則主要關(guān)注的是分子和細胞的結(jié)構(gòu)和功能；加利福尼亞大學伯克利分校含有綜合生物學與分子和細胞生物學兩個專業(yè)，后者包括生物化學和分子生物學方向、細胞和發(fā)育生物學方向、遺傳學和發(fā)育方向、免疫學方向以及神經(jīng)生物學方向。美國一流高校在生物技術(shù)人才培養(yǎng)上的顯著特點是：將生物學的二級學科作為本科人才培養(yǎng)的方向（又稱為課程方案）。在我國只有“985”，“211”大學才具備將生命科學的專業(yè)分支建設為生物技術(shù)的專業(yè)培養(yǎng)方向的能力，其原因主要是生物技術(shù)為實驗性科學、需要大量的高端生物技術(shù)相關(guān)設備以及相應的研究型學者師資。國內(nèi)獨立學院受師資、設備和資金的局限性，2013年辦學較好的前十個獨立院校中只有華中科技大學武昌分校、燕山大學里仁學院、北京師范大學珠海分校舉辦生物類專業(yè)，而且在傳統(tǒng)意義上，獨立學院生物技術(shù)學科布局非常不完善，不可能看齊國內(nèi)外一流大學，將生物學的二級學科建設為多個人才專業(yè)方向。因此，將生物技術(shù)人才培養(yǎng)與產(chǎn)業(yè)應用相結(jié)合，跨學科建設專業(yè)方向，延展學科資源共享效益，建立特色課程體系并付諸實踐是獨立學院舉辦特色生物技術(shù)相關(guān)專業(yè)的關(guān)鍵步驟。珠海市食品、醫(yī)藥和醫(yī)療機械制造產(chǎn)業(yè)發(fā)達，社會對跨學科的生物技術(shù)專業(yè)體現(xiàn)出的能力要求表現(xiàn)為食品安全領域的生物技術(shù)應用需求、制藥領域的生物技術(shù)應用需求以及醫(yī)療器械領域?qū)ι锛夹g(shù)的應用需求。北京師范大學珠海分校在學科布局上對生物技術(shù)在專業(yè)方向設置上提供了很好的跨專業(yè)資源共享平臺。我們結(jié)合泛珠三角經(jīng)濟發(fā)展需求、依據(jù)自身實際條件首先確立如下專業(yè)培養(yǎng)目標：培養(yǎng)擁有扎實的現(xiàn)代生物技術(shù)基礎理論，系統(tǒng)掌握生物技術(shù)的應用實踐技能，富有利用生物技術(shù)研發(fā)生物制品的科學思維與實踐能力，可從事生物制造與生物制品安全以及食品檢驗檢疫等領域中生物技術(shù)應用的相關(guān)研發(fā)與管理工作的高素質(zhì)專門化應用型人才。同時，在未來5-10年內(nèi)逐步規(guī)劃制藥領域、醫(yī)療器械領域的應用型人才培養(yǎng)方向，服務珠海市生物技術(shù)跨學科應用型人才需求。
2關(guān)于課程模塊的優(yōu)化實踐
生物技術(shù)課程模塊式優(yōu)化有利于適用于社會對人才培養(yǎng)的需求，也有利于課程設置的穩(wěn)定性，容易總結(jié)經(jīng)驗提高教學質(zhì)量。經(jīng)過7年的改革實踐，我校生物技術(shù)課程模塊優(yōu)化主要分為三個部分：一是精準勾勒專業(yè)知識模塊。模塊優(yōu)化主要使學生清楚哪些是生物技術(shù)專業(yè)的核心課程，哪些是自己必須了解的生物基礎知識。生物技術(shù)專業(yè)課程體系包括微生物學、細胞生物學、遺傳學、動物學、植物學、生態(tài)學、植物生理學、動物生理學、生物化學、分子生物學、工業(yè)微生物學育種學、基因工程、細胞工程、微生物工程、生化工程、生物工程下游技術(shù)、發(fā)酵工程設備、酶工程等專業(yè)內(nèi)容。受限于160學分的總限制，生物技術(shù)專業(yè)不可能將所有的內(nèi)容都開設成單獨的課程，而且各類課程中重復性內(nèi)容較多，不利于學生綜合掌握專業(yè)基礎知識，因此在專業(yè)課程內(nèi)容設置上，必須做到“有基礎，有專業(yè)”。有基礎，用12個學分構(gòu)建生物技術(shù)的專業(yè)基礎知識結(jié)構(gòu)，共5門理論課程，知識點覆蓋微生物學、細胞生物學、遺傳學、動物學、植物學、生態(tài)學、植物生理學、動物生理學、生物化學、分子生物學、微生物學、人體結(jié)構(gòu)與生理等上游生物技術(shù)基礎知識；有專業(yè)，用20個學分構(gòu)建五個核心專業(yè)課程，含基因工程與分子生物學，細胞工程，發(fā)酵工程，蛋白質(zhì)工程原理及應用，酶學原理與酶工程。二是構(gòu)筑適應社會需求的專業(yè)應用模塊。專業(yè)方向課程的設置要具備一定的靈活性，以應用性、實用性為準則，必修和選修互補，模塊上除設置食品安全檢驗檢疫生物技術(shù)必修模塊外，充分考慮學生就業(yè)、升學、留學需求，盡可能提供適應學生需求的選修課程模塊，滿足個性發(fā)展需求。專業(yè)方向必修模塊包括：現(xiàn)代儀器分析、HACCP原理與應用、分子生物學檢測技術(shù)、食品安全控制技術(shù)、食品衛(wèi)生毒理學、現(xiàn)代食品分析技術(shù)。專業(yè)方向選修模塊包括：生物化學和分子生物學、細胞和發(fā)育生物學、遺傳學、發(fā)育生物學、免疫學、神經(jīng)生物學、藥物設計與藥物研究、生物物理學、生物儀器分析、工程制圖、電工電子學等。總之，專業(yè)方向課程模塊優(yōu)化的方向是甩開傳統(tǒng)學科分類包袱，以實際應用為導向，以現(xiàn)實資源為依托，開展交叉學科人才培養(yǎng)適應社會需求。三是夯實提高學生實踐能力的實踐模塊。人才培養(yǎng)要做到實效性，必須用實驗課程來培養(yǎng)學生。我們逐步取消了一課一實驗配套的辦法，將所有實驗課整合成獨立規(guī)劃的實踐課程，綜合后分為4個階段：第一階段主要在各專業(yè)實驗課里完成，實行課堂化管理（分為四個技能訓練課程，每周4-6學時），最后考察評價，夯實基本生物技術(shù)實驗能力；第二階段在專題研究課程內(nèi)完成，教師單獨輔導，以開題報告，研究報告作為評價標準，獲得相應學分；第三階段主要在國內(nèi)外實踐基地統(tǒng)一組織、自由安排時間進行專業(yè)技能培訓，以大量的實踐、見習、參觀為主要手段，融入部分畢業(yè)實習內(nèi)容，獨立撰寫實習報告；第四階段主要在校內(nèi)外實驗室完成，根據(jù)畢業(yè)論文具體要求，在相應實驗結(jié)果前提下，獨立撰寫畢業(yè)論文，并參加答辯。
3關(guān)于保障生物技術(shù)課程體系實施的實驗條件
生物技術(shù)在學科劃分上理工不分，即可以發(fā)理學學位，也可以發(fā)工學學位，實驗科學的特性決定了生物技術(shù)人才培養(yǎng)的高成本，高投入。獨立學院自籌經(jīng)費的特點決定了學校在舉辦生物類專業(yè)上與公辦高校在人才、資金投入上相去甚遠的現(xiàn)狀。我校作為高等教育改革試驗區(qū)，舉辦生物技術(shù)專業(yè)同樣面臨資金、人才匱乏局面。只有通過社會資源的整合，協(xié)同創(chuàng)新辦學體制才能解決生物技術(shù)專業(yè)對高端設備的需求，同時實踐基地的建設要從人才培養(yǎng)的角度出發(fā)，設備應符合現(xiàn)代生物技術(shù)人才培養(yǎng)以及特色專業(yè)培養(yǎng)目標的需求。經(jīng)過文獻搜索和對珠海300家企業(yè)的調(diào)研發(fā)現(xiàn)：與用人單位共同培養(yǎng)食品安全領域的生物技術(shù)應用人才符合國家和珠海地區(qū)發(fā)展的需要。2007年我校與國家進出口檢驗檢疫局珠海局正式簽署協(xié)議協(xié)同培養(yǎng)生物技術(shù)專業(yè)人才。通過辦學模式的創(chuàng)新，“平等自愿、產(chǎn)權(quán)不變、協(xié)同建設、資源共享”的方針使得雙方能夠大膽持續(xù)投入，共建共享實驗室，至今我校已經(jīng)建立了分子生物學、衛(wèi)生檢驗檢疫兩個國家級實驗室，部分生物實驗室達到生物安全二級水平，實驗條件滿足生物技術(shù)課程體系的教學實踐要求。另外，在實踐課程經(jīng)費投入方面，生均實驗材料費為750元/人，學院預算儀器購置費為2857元/生，年度生均實踐環(huán)節(jié)總投入為3607元/生，將教育部2004年2號文件“學費20%直接用于教學”的規(guī)定不打折扣落到實處。
4生物技術(shù)課程體系改革實踐效果
學生服務社會的能力是課程體系改革成功與否的試金石。首先，實驗條件是實現(xiàn)生物技術(shù)專業(yè)課程體系規(guī)劃的重要保障，“檢學”協(xié)同創(chuàng)建高水平的、可持續(xù)發(fā)展的專業(yè)實驗室體系為執(zhí)行生物技術(shù)課程體系，進行人才培養(yǎng)、創(chuàng)造了先進的實驗室基礎，學生實驗訓練得到有力的保障；其次，通過實驗室共建、資源共享，協(xié)同管理，把直接為企業(yè)提供食品安全檢測的國家級區(qū)域性中心實驗室對學生開放，作為學生通過高層次技術(shù)服務學習的平臺，對學生具有深遠的“學有所用”的意義，學生能夠用自己的專業(yè)知識直接服務于社會，并作為切身利益方對課程體系設置的反饋能夠直接基于社會的實際需求，這優(yōu)于任何第三方去評價課程體系改革效果；最后，摸索出了適應特殊機制大學應用型生物技術(shù)人才培養(yǎng)課程體系，取得了明顯效果，學生升學率達20%，就業(yè)率高于地區(qū)平均水平，學生得到了實實在在的收獲。
參考文獻：
[1]劉春惠.論“學科”與“專業(yè)”的關(guān)系[J].北京郵電大學學報(社會科學版),2006,(2):66-71.
第8篇：細胞生物學特性范文
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第9篇：細胞生物學特性范文
熒光分析法由于其較高的檢測靈敏度而成為生命科學研究領域重要的研究方法之一，其檢測靈敏度在很大程度上依賴于熒光標記物的熒光強度和光學穩(wěn)定性。目前使用的傳統(tǒng)有機熒光材料由于吸收波長范圍較窄，使用時僅能在較窄的波長范圍內(nèi)選擇特定波長的光對其進行激發(fā)，而且其發(fā)射光譜較寬，不同熒光材料的發(fā)射光譜有可能互相重疊，從而降低了同時使用不同熒光材料對不同分子進行熒光標記和分析的可能性。此外，傳統(tǒng)有機熒光材料的發(fā)射光譜一般不具有對稱性，信噪比和穩(wěn)定性相對較低，在光照幾分鐘后即發(fā)生褪色現(xiàn)象。這些缺陷極大限制了其在生命科學領域更為深入廣泛的應用。量子點一般是指尺寸小于激子玻爾半徑的Ⅱ-VIA或Ⅲ-VA元素化合物所形成的納米晶體。當可見光的光子照射到量子點上時，量子點的某些電子會被激發(fā)至較高能級，當這些電子從較高能級回到其基態(tài)時，量子點就會以熒光的形式發(fā)出特征頻率的光子［3］。
與傳統(tǒng)的有機熒光材料相比，量子點具有較大的吸收范圍，因而能夠在較寬的波長范圍內(nèi)被激發(fā)從而發(fā)出熒光，利用這一性質(zhì)，可以在單一的激發(fā)波長下使用多種量子點進行熒光標記［4，5］。而且，量子點的發(fā)射光譜較窄且具有對稱性，因而不同量子點的發(fā)射光譜之間基本不存在相互重疊()。此外，可以通過對量子點的粒徑、組成和表面性質(zhì)進行修飾從而對量子點的發(fā)射波長進行調(diào)控，使得量子點可以在從紫外到紅外波長范圍內(nèi)的特定頻率下發(fā)射熒光，利用這一特點，可以通過合成方法設計制備出大量發(fā)射波長不同的量子點［6，7］。此外，與有機熒光材料相比，量子點具有較高的穩(wěn)定性，可以在數(shù)小時內(nèi)經(jīng)歷多次激發(fā)和熒光發(fā)射的循環(huán)過程，而且其熒光具有較高的亮度和褪色閾值。量子點的上述幾個特性使得其非常適合于進行復合熒光標記，進行標記時可以根據(jù)不同量子點所具有的不同顏色和強度的熒光對不同的靶向分子進行標記。在利用量子點進行生物熒光標記的研究初期，由于一些技術(shù)性原因，尤其是量子點表面包覆問題，在標記時存在熒光強度、選擇性和分辨率較低等問題。作為量子點生物熒光標記的早期研究者之一，Bruchez等［6］將CdSe-CdS量子點表面包覆細胞生物素，并首次成功利用其對小鼠3T3成纖細胞進行熒光標記，但標記后的熒光信號強度較低，且絕大部分量子點非特異性地分布在核膜上。
與此同時，Nie等［7］利用轉(zhuǎn)鐵蛋白對CdSe-ZnS量子點進行包覆，并經(jīng)過受體介導的細胞內(nèi)吞作用進入HeLa細胞對其進行體外熒光標記，以識別IgG免疫抗原，并利用IgG修飾的CdSe-ZnS量子點對免疫抗體進行熒光標記，但其特異性仍然較低，且未進行體內(nèi)標記測試。盡管利用量子點進行生物熒光標記的初期研究存在上述問題，但仍然引起了研究人員極大的興趣，在材料學及生物科學領域引發(fā)了廣泛的研究熱潮。隨著材料表面科學和生物醫(yī)學的深入研究，利用量子點進行生物熒光標記在熒光強度、特異性及靈敏度等方面得到了極大的發(fā)展。Wu等［8］利用免疫抗原IgG和鏈酶親和素對CdSe-ZnS量子點進行修飾，然后利用其對人體乳腺癌細胞SK-BR-3進行體外及體內(nèi)熒光標記，以檢測細胞表面的腫瘤標記物Her2(人類表皮生長因子受體2)。測試結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的有機熒光標記方法相比，該方法具有極高的特異性，且顯示出優(yōu)異的熒光強度和熒光穩(wěn)定性。更為重要的是，該研究顯示利用兩種發(fā)射波長不同的量子點即免疫抗原IgG修飾的量子點和鏈酶親和素修飾的量子點，可以在同一激發(fā)波長下同時對小鼠3T3成纖細胞2種不同的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子肌動蛋白和微管蛋白進行熒光標記，表明與傳統(tǒng)的有機熒光材料相比，量子點可以更為有效的同時對多種細胞內(nèi)分子進行熒光標記。2004年，Nie等［9］使用兩親三嵌段共聚物對TOPO包覆的CdSe-ZnS量子點進行修飾，并在其外表面連接各種腫瘤特異性配體，利用其對裸鼠體內(nèi)的人體前列腺腫瘤細胞進行標記。
結(jié)果表明，通過量子點表面連接的腫瘤特異性抗體，量子點可以有效定位于腫瘤細胞并與細胞表面的腫瘤特異性生物標記物相結(jié)合，通過波長分辨成像技術(shù)，成功對成活裸鼠體內(nèi)的腫瘤細胞進行高靈敏度多色熒光標記()。隨著研究的不斷深入和拓展，量子點在體外生物熒光標記方面的應用目前已進入較為成熟的階段。Xie等［10］利用生物素與鏈酶親和素之間的特異性相互作用，將小鼠肝癌細胞MEAR中的DNA適配體(TLS9a)生物素化，將其連接于鏈酶親和素修飾的量子點上，制備出生物熒光探針。利用該探針對不同腫瘤細胞及正常細胞進行熒光標記。結(jié)果表明，該探針能夠特異性識別MEAR小鼠肝癌細胞，且該探針具有良好的生物相容性，在對MEAR細胞識別后未對細胞生長和細胞存活產(chǎn)生毒副作用()。Dong等［11］將水溶性CdTe量子點與大鼠抗小鼠CD4抗體相連接，并利用其對大鼠脾臟進行熒光檢測。結(jié)果表明，該熒光探針可以有效對大鼠脾臟進行直接熒光標記，而且與常用的有機熒光材料異硫氰酸熒光素(FITC)相比，該熒光探針顯示出優(yōu)異的熒光檢測強度及良好的熒光穩(wěn)定性。
2靶向藥物輸送
在藥物研發(fā)和藥物治療領域，藥物輸送是一個必須考慮的重要因素。藥物的靶向輸送對于多種疾病如癌癥和神經(jīng)性疾病的治療至關(guān)重要。因而，目前對藥物的靶向輸送研究已成為藥物研發(fā)和藥物治療的核心問題之一。對于一個藥物輸送體系而言，其尺度大小對于有效將相關(guān)藥物輸送至細胞內(nèi)部至為關(guān)鍵。由于血管自身孔徑的限制，僅允許直徑小于50nm的藥物自由進出，而對于細胞，僅有直徑小于100nm的藥物可穿透細胞膜進入其內(nèi)部發(fā)揮療效。目前，僅有人工合成的納米輸送系統(tǒng)能夠較好的滿足這一要求。此外，藥物的溶解性是影響藥物療效的重要因素之一，而目前近半數(shù)的化學合成藥物在水中是不溶的或溶解性較差，嚴重影響了藥物充分發(fā)揮其療效，因而已成為目前藥物藥物治療領域的一個主要問題。
納米顆粒由于其特有的性質(zhì)，使其在藥物輸送方面具有廣闊的應用前景。由于其較小的尺寸，使得納米顆粒能夠較為有效地進入細胞內(nèi)部。納米顆粒較大的比表面積使其能夠有效結(jié)合、吸附及輸送其它化合物如小分子藥物、多肽、蛋白質(zhì)及核酸分子，而且其較大的比表面積賦予納米顆粒所負載的藥物分子良好的藥物動力學特性及其在靶向組織器官中優(yōu)異的生物分散性，進而可以有效的提高藥物療效［12，13］。納米顆粒具有優(yōu)先聚集于靶向位點的特性，這一特性使其所負載的藥物在健康的組織器官部位的濃度較低，從而可以最大程度地降低納米顆粒及藥物本身的毒副作用［14］。而且，納米顆?？梢杂行岣呤杷幬镌诤橘|(zhì)中的溶解性，使疏水藥物能夠適合于進行非腸道給藥治療。納米顆粒還可以有效提高多種藥物如疏水藥物分子、多肽及寡聚核苷酸的穩(wěn)定性［15，16］。此外，生物可降解的納米輸送體系可以大幅度提高藥物的生物相容性，并可在最大程度上降低藥物本身的超敏反應，如呼吸困難、皮疹、胸痛、心跳過速、水腫及外周神經(jīng)炎癥［17，18］。Bahadur等［19］首先利用氨基硅烷對Fe3O4納米顆粒進行包覆以實現(xiàn)其氨基官能化，然后通過Michael加成反應將丙烯酸甲酯和精氨酸接枝于納米顆粒表面，形成平均粒徑在10nm左右的樹枝狀磁性納米顆粒藥物載體。細胞生物學測試結(jié)果表明，該樹枝狀磁性納米顆粒本身對Hela細胞無細胞毒性，顯示出良好的生物相容性。
通過靜電相互作用將抗癌藥物鏈霉菌成功結(jié)合于該磁性納米顆粒表面，測試結(jié)果表明，在最佳酸度條件下，藥物分子可以有效得以釋放，且在外加磁場作用下，其藥物釋放效率可以得到極大提高()。Wheate等［20］利用含氨基的磺基化聚乙二醇對直徑為30nm左右的金納米顆粒進行修飾，以提高其水溶性及有效載藥量，然后將抗癌藥物草酸鉑連接于該納米顆粒表面。電子探針顯微分析結(jié)果顯示，與超支化聚合物及樹枝狀聚合物相比，其有效載藥量可大幅度提高。細胞生物學測試表明，與純的草酸鉑相比，該官能化金納米顆?？蓪⒛[瘤細胞內(nèi)的藥物濃度提高1倍。此外，在負載草酸鉑之前，官能化的金納米顆粒對腫瘤細胞未顯示明顯的抑制作用。而在負載草酸鉑之后，與純的草酸鉑相比，其對腫瘤細胞的抑制率可有效提高5～6倍。Hanessian等［21］利用端基分化疊氮二羧酸將抗腫瘤藥物喜樹堿共價連接于聚乙烯胺分子上，然后將其負載于超順磁氧化鐵納米顆粒上。將該生物連接體作用于人體黑素瘤細胞并進行相關(guān)測試，熒光發(fā)射光譜及透射電子顯微鏡測試結(jié)果表明，該生物連接體可有效進入腫瘤細胞內(nèi)并定位于脂類囊泡中。細胞生物學測試結(jié)果表明，在外加磁場作用下，通過該生物連接體的酯水解作用，其所負載的喜樹堿可自脂類囊泡中有效釋放并進入細胞核中，從而明顯提高了藥物療效()。
3生物分子檢測
在生物醫(yī)學領域，DNA和蛋白質(zhì)的檢測對于疾病的診斷、遺傳性疾病的治療以及傳染性病原體的檢測極為重要。目前，對于DNA分子的分析一般先通過聚合酶鏈式反應(PCR)對其進行擴增，然后利用有機熒光染色劑對其標記從而加以檢測，該方法對于DNA的檢測下限為pmol。然而，該分析方法存在本質(zhì)上的缺陷，比如，有機熒光染色劑過寬的吸收峰和發(fā)射峰及其熒光猝滅的不均勻性均會明顯降低該方法的檢測靈敏度，而且PCR過程中的選擇性及非線性擴增現(xiàn)象會導致DNA表達的失真。對于蛋白質(zhì)，目前均通過免疫染色的方法對其進行分析檢測，酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)依然是蛋白質(zhì)的標準檢測手段，該方法的檢測下限同樣為pmol。對于多種疾病而言，在發(fā)病初期或緩解期，其相應的生物標志物如特異性蛋白質(zhì)分子僅以fmol的極低濃度存在于患者體內(nèi)，ELISA對于如此低濃度的蛋白質(zhì)分子的檢測無能為力。當這些特異性蛋白質(zhì)分子濃度提高至ELISA的臨界檢測濃度時，一般疾病已發(fā)展至晚期。因而，尋找具有更高靈敏度的生物分子檢測手段對于疾病的早期診斷至關(guān)重要。納米顆粒由于其較小的尺寸、較高的反應活性、優(yōu)異的物理性質(zhì)以及這些性質(zhì)的可調(diào)控性，使其在制備用于蛋白質(zhì)、核酸分子檢測的生物親和性傳感器方面受到廣泛關(guān)注，可以利用其建立新的檢測方法以改善目前的檢測方法所存在的缺陷，因而具有良好的應用前景。
Jia等［22］將人癌胚抗原(CEA)的檢測抗體和單鏈DNA(ssDNA)連接于直徑為13nm左右的金納米顆粒表面，再將辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉親和素連接于ssDNA上，制成酶標記金納米探針。然后，通過碳二亞胺活化的共價偶合作用，將抗CEA捕捉抗體連接于羧基官能化的磁性微粒上，以制備磁性探針。在利用酶標記金納米探針和磁性探針對相應抗原進行免疫檢測時，磁性探針首先通過其連接的捕捉抗體與抗原相結(jié)合，而該抗原又同時與酶標記金納米探針上的檢測抗體相結(jié)合，然后在外加磁場作用下對其進行分離，最終利用酶標儀對其進行檢測。結(jié)果顯示，該檢測方法可以顯著提高對CEA抗原的檢測靈敏度，比常規(guī)ELISA的檢測靈敏度提高130倍左右，而對于非特異性蛋白如p53則僅顯示出較弱的響應()。Rusling等［23］以谷胱甘肽為修飾劑，制備出粒徑為5nm左右的可溶性金納米顆粒，并通過層層組裝的方式將聚(二甲基二烯丙基氯化銨)(PDDA)和谷胱甘肽-金納米顆粒組裝于熱解石墨上以形成納米金電極，利用EDC［1-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽］—NHSS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)偶聯(lián)技術(shù)使連接于PSA(前列腺特異性抗原)上的一抗與電極上金納米顆粒層中的谷胱甘肽羧酸根通過共價鍵的方式相結(jié)合，從而將PSA固定于納米金電極上以組成檢測電極。
利用該檢測電極對PSA進行檢測時，首先將抗PSA抗體(二抗)和HRP連接于磁球上，制成二抗-磁球-HRP生物復合物，并將檢測電極浸入該生物復合物中，然后將H2O2注入檢測體系中，測定HRP中的Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)氧化-還原電流。由于H2O2可將HRP轉(zhuǎn)變?yōu)榭芍苯颖浑姌O還原的亞鐵氧(ferryloxy)態(tài)，因而造成循環(huán)伏安檢測結(jié)果中的氧化峰消失，而還原峰有所增大。通過對體系的電流檢測并對數(shù)據(jù)進行進一步處理，即可以得出體系中PSA的濃度。與常規(guī)的ELISA方法相比，該方法可以將PSA的檢測靈敏度提高2000倍左右，并成功檢測出前列腺腫瘤患者血漿樣品中的PSA()。
4細胞及生物分子的分離純化
細胞及生物分子如蛋白質(zhì)等的分離技術(shù)是細胞生物學、免疫學、干細胞研究及臨床醫(yī)學研究中的一種重要研究工具。細胞的分離、純化及表征已經(jīng)成為生命科學及臨床醫(yī)學領域中必不可少的手段之一。例如，自體骨髓移植就要求對腫瘤細胞進行高效去除，在腫瘤的早期臨床診斷中要求對患者血液中的少量腫瘤細胞進行分離富集;另外，分離T淋巴細胞并對其功能性進行診斷在確定人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾滋病和自身免疫性疾病的發(fā)展進程中至關(guān)重要［24，25］。基于細胞分離技術(shù)在上述領域的重要性，目前對于細胞分離技術(shù)的研究著重于發(fā)展出可明顯提高稀有細胞(如干細胞、抗原特異性B細胞和T細胞及稀有性外周血循環(huán)腫瘤細胞)的分離純度和分離效率的有效方法。由于大多數(shù)靶細胞的存在濃度極低，使得目前對于這些細胞的高純度分離仍然較為困難［26］。目前常用的細胞分離方法可以分為兩大類，第一類是基于細胞的物理性質(zhì)如尺寸、形貌和密度差異，通過過濾和離心的方法對細胞加以分離;第二類則是利用細胞表面的生化特性和生物物理性質(zhì)對細胞加以分離，如固體親和基質(zhì)分離法和熒光活化細胞分揀法。一種理想的細胞分離方法應該是能在不影響細胞功能的前提下于短時間內(nèi)分離出大量高純度靶細胞。
目前的這些分離方法仍然存在較多不足之處，過濾和離心的方法對細胞存活率有較為顯示的副作用，選擇性較差且不易大規(guī)模進行;熒光活化細胞分揀法盡管具有較高的選擇性，但其效率較低，且具有較高的技術(shù)要求。因而，尋找出一種產(chǎn)量、純度和收率均較高的細胞分離方法迫在眉睫。近年來新出現(xiàn)的磁性分離方法已經(jīng)成為生物學和臨床醫(yī)學上一種重要的對細胞和蛋白質(zhì)進行選擇性分離的技術(shù)，它可以對細胞進行大批量分離，且獲得的靶細胞純度較高［27，28］。Gu等［28］將氨基三乙酸連接于粒徑為8～10nm的磁性納米顆粒表面，由于納米顆粒的高比表面積、快速的移動性及良好的分散性，使得其與組氨酸標記的蛋白質(zhì)分子之間具有較高的結(jié)合效率，而且磁性納米顆粒的使用使得在對蛋白質(zhì)分子進行分離時無需對細胞裂解液進行預處理。在外加磁場的作用下，對組氨酸標記的蛋白質(zhì)進行分離，并利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDA-PAGE)對其產(chǎn)物純度進行檢測，結(jié)果表明，分離產(chǎn)物中僅含有組氨酸標記的蛋白質(zhì)，其分離特異性顯著優(yōu)于商業(yè)化磁性微球。該功能化磁性納米顆粒對靶蛋白分子的結(jié)合力為商業(yè)化磁性微球的200倍，且利用緩沖溶液對該功能化磁性納米顆粒進行重生后，其對靶蛋白的親和能力、選擇性和分離效率可以完全恢復并進行重復利用。Earhart等［29］通過將生物樣品特異性抗體連接于磁性納米顆粒表面以實現(xiàn)其功能化，然后在外加磁場的作用下將待分離樣品通過含有功能化磁性納米顆粒的分離篩，分離篩狹縫周圍的磁性納米顆粒被外加磁場磁化，從而產(chǎn)生較高的局部磁場梯度，并在狹縫處產(chǎn)生邊緣磁場。由于局部磁場梯度的作用，磁性納米顆粒及其所捕獲的靶細胞被富集于狹縫處，其它成分則可自由通過分離篩。去除外加磁場并利用合適的緩沖溶液沖洗分離篩，即可對靶細胞進行釋放富集。利用該方法對靶細胞的捕獲效率可以達到37%，而且捕獲到的靶細胞可以實現(xiàn)完全富集()。
5磁共振成像(MRI)增強
MRI技術(shù)作為一種臨床診斷技術(shù)，廣泛應用于臨床醫(yī)學及基礎研究中以提供高質(zhì)量的人體解剖圖像。在臨床診斷中，基于解剖學差異，作為一種無損技術(shù)的MRI可利用強磁場和射頻范圍內(nèi)的非電離輻射對正常組織和病變組織(如腫瘤)加以區(qū)分［30］。MRI信號依賴于徑向和橫向質(zhì)子的弛豫時間，正是二者之間的差異造成了不同組織在MRI圖像中的對比度有所不同。機體組織中水分的內(nèi)在弛豫時間與其生理環(huán)境有關(guān)，因而其在病變組織中會有所改變，盡管這種變化的特異性較小，但在病變晚期，該特異性會明顯增強。因此，MRI非常適合于對病變進行特異性診斷。利用MRI造影劑可以對組織的弛豫時間加以調(diào)控，從而提高圖像的信號強度和對比度。目前MRI技術(shù)的應用越來越依賴于造影劑，MRI技術(shù)和造影劑的聯(lián)合使用可以極大地提高對血管系統(tǒng)［31］、炎癥組織［32］、腫瘤血管形成［33，34］、動脈粥樣硬化斑塊［35，36］以及血腦屏障損傷［37］的成像效率。在新出現(xiàn)的細胞和分子磁共振成像技術(shù)中，造影劑已成為該技術(shù)中的關(guān)鍵因素。該技術(shù)力圖在分子和細胞水平上將疾病特異性生物標志物可視化，其中納米顆粒被廣泛用作造影劑，基于納米顆粒的細胞攝取，這一新穎的磁共振成像技術(shù)可以追蹤組織器官內(nèi)由磁性納米顆粒標記的細胞在時間和空間上的移動。
Harisinghani等［38］使用低分子量葡聚糖對粒徑為2～3nm的超順磁氧化鐵納米顆粒進行包覆，以形成親淋巴細胞納米顆粒，葡聚糖的引入可以明顯延長納米顆粒的循環(huán)時間并有效抑制其團聚現(xiàn)象。通過靜脈注射使該納米顆粒進入患者循環(huán)系統(tǒng)，利用其作為造影劑，對患者進行MRI診斷。成像結(jié)果顯示，在惡性腫瘤部分不存在或僅存在少量納米顆粒，故不顯示黑色或僅在邊緣部分顯示黑色，而在良性腫瘤部位存在大量納米顆粒，顯示較深的黑色，在腫瘤從良性發(fā)展為惡性的過程中，其黑色會逐漸變淺。以上結(jié)果表明，該方法可以有效區(qū)分良性腫瘤和惡性腫瘤，并可根據(jù)圖像中的顏色深淺對腫瘤的發(fā)展階段加以判斷。Zhang等［39］以PVP為穩(wěn)定劑和修飾劑，通過共沉淀法合成出粒徑分別為2nm和7nm的氧化鐵納米顆粒。通過尾靜脈注射的方式將該功能化納米顆粒注入實驗小鼠體內(nèi)，并將實驗小鼠置于外加磁場30min后對其進行MRI檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，由于外加磁場的作用，納米顆粒主要集中于靶向區(qū)域，而且注射功能化納米顆粒的小鼠在肺、肝和腎等部位的陰性對比度明顯增強。這表明，該功能化氧化鐵納米顆粒可以在外加磁場作用下定位于特定的靶向組織，并作為MRI診斷的陰性造影劑使用()。
6腫瘤治療
目前，癌癥是世界上主要的致命性疾病之一，而且近年來全球范圍內(nèi)的癌癥發(fā)病率不斷提高，嚴重威脅著人類的生命安全。根據(jù)美國癌癥學會的統(tǒng)計數(shù)字，2009年全美有近250萬新增癌癥患者，有超過56萬的患者死于各種癌癥，相當于每天超過1500名患者死于癌癥［40］。目前針對癌癥的治療方法僅限于藥物療法、放射療法和臨床手術(shù)療法，這些常規(guī)治療方法存在著抗癌藥物在患者體內(nèi)的非特異性分布、腫瘤部位有效藥物濃度過低、對于治療效果的監(jiān)測手段有限以及藥物向靶向部位輸送效率較差等問題，因而，建立新的癌癥治療手段已經(jīng)迫在眉睫。由于納米顆粒具有較小的粒徑，使其能夠較為順利的通過癌細胞的細胞膜進入細胞內(nèi)部，而且其較大的比表面積使其具有較高的活性，因而近年來在癌癥治療領域受到廣泛的關(guān)注。Yang等［41］以牛血清白蛋白(BSA)為修飾劑，通過溶液合成法，分別合成出粒徑為65nm的Ag2S納米顆粒和直徑為40nm、長度為220nm的Ag2S納米棒，通過氧化鋁模板法合成出直徑為50nm、長度超過1μm的Ag2S納米線，紅外和染色測試結(jié)果顯示，BSA被成功包覆于3種Ag2S樣品表面。
將上述3種Ag2S納米樣品作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，細胞生物學測試結(jié)果表明，與對照組相比，3種樣品均能明顯抑制腫瘤細胞的增殖，顯示出其在治療腫瘤方面的潛在應用。此外，他們［42］在無外加修飾劑的作用下，通過調(diào)控反應條件，利用溶液合成法，分別合成出粒徑為50nm的CuS無定形納米顆粒和粒徑為60nm的CuS納米晶體。將2種樣品作用于HL-60白血病細胞、HepG2肝癌細胞及V79-4倉鼠正常細胞并進行相關(guān)細胞生物學測試。流式細胞、熒光染色及MTT檢測結(jié)果顯示，與體相晶體相比，2種CuS納米樣品均能顯著誘導2種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而顯著抑制腫瘤細胞的增殖，而2種樣品對正常細胞則均未顯示出誘導細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用，這表明2種CuS納米樣品可以通過特異性誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡從而抑制其增殖。更為重要的是，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，2種樣品對于腫瘤細胞的誘導凋亡及抑制增殖活性具有顯著性差異，CuS無定形納米顆粒的上述2種活性均明顯強于CuS納米晶體，表明其抗腫瘤活性具有明顯的晶型相關(guān)性(0)。
7其它應用
除了在上述領域具有廣泛的應用外，納米材料在其它一些領域如組織工程學、細胞及生物分子調(diào)控、細胞吞噬動力學研究等方面也受到了越來越廣泛的關(guān)注。比如，Shen等［43］利用原位沉淀法制備出殼聚糖-聚乳酸/羥基磷灰石復合納米材料，殼聚糖和聚乳酸的加入可以大幅度提高羥基磷灰石的彈性模量和耐壓強度等機械性能，顯示其可以作為潛在的骨骼修復材料。
